基于16srrna靶序列的熒光原位雜交技術(shù)在環(huán)境微生物群落研究中的應(yīng)用

結(jié)果表明，祖母腸微生物與主體內(nèi)的微生物密切相關(guān)（vlkova等人，2006）。因此，正確分析動物腸道中微生物多樣性與微生物多樣性之間的相互作用具有重要意義。但由于動物腸道內(nèi)微生物群落復(fù)雜而且數(shù)量龐大,導(dǎo)致應(yīng)用傳統(tǒng)方法很難準(zhǔn)確定量(Chierici等,2003)。傳統(tǒng)方法研究動物腸道中微生物群落結(jié)構(gòu)一直建立在分離和培養(yǎng)的基礎(chǔ)之上,這種方法有兩大缺陷,一是胃腸道有些細(xì)菌很難或不能通過培養(yǎng)基培養(yǎng)存活;二是以前認(rèn)為的特異性培養(yǎng)基只是相對特異,用這種培養(yǎng)基對某種細(xì)菌計數(shù)并不準(zhǔn)確(Amannri等,1995;Rossello-Morar等,2001)。用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所得出的研究結(jié)果不能準(zhǔn)確反映腸道微生物群落的組成和生態(tài)演替情況。因此,建立和發(fā)展一種不依賴微生物培養(yǎng)的方法來監(jiān)測微生物群的變化是非常有必要的。20世紀(jì)80年代末,分子生物學(xué)技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于動物胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析,而且發(fā)展迅速,研究焦點集中在微生物保守序列的16SrRNA上,尤其是微衛(wèi)星SSR(simplesequencerepeats,SSR)、內(nèi)部簡單重復(fù)序列(inter-simplesequencerepeat,ISSR)、擴增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)和變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)等方法的應(yīng)用,不斷為研究微生物種群和鑒定微生物提供新的途徑。但是,這些基于PCR的方法可能會在擴增反應(yīng)中引入誤差,降低所得信息的精確度。熒光原位雜交技術(shù)作為一種不依賴PCR的分子分析技術(shù),是對上述各種分子標(biāo)記技術(shù)存在缺陷的有益補充,其主要特點是結(jié)合了分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性,能夠同時提供關(guān)于微生物形態(tài)、數(shù)量、空間分布與細(xì)胞環(huán)境方面的信息(Choi等,1994),使人們可以在自然或人工的微生物環(huán)境中監(jiān)測和鑒定不同的微生物個體,并對微生物群落進行評價(Raap等,1998)。1微生物二維碼分析熒光原位雜交技術(shù)是采用熒光染料標(biāo)記的、以微生物的核糖體小亞基為靶標(biāo)的寡核苷酸探針,與固定好的微生物樣品進行原位雜交,將未雜交的熒光探針洗去后用熒光顯微鏡進行觀察和攝像,對微生物類群進行原位分析和空間位置示標(biāo)(張彤等,2003)。熒光原位雜交技術(shù)檢測微生物樣品的操作主要包括以下步驟(Delong等,1989):用多聚甲醛將微生物細(xì)胞固定;將固定好的細(xì)胞固定在明膠包被過的載玻片上,用梯度濃度乙醇脫水;在雜交溫度下,用探針進行雜交;清洗多余探針;用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidimo-2-phenyhndole,DAPI)復(fù)染;將樣品封片,利用熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。2原生動物雜交技術(shù)在腸道微生物定量中的應(yīng)用2.1熒光原位雜交技術(shù)雙歧桿菌作為動物胃腸道中的優(yōu)勢菌之一,在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近400種其他腸道菌形成棲生、偏生、共生、競爭或吞噬等復(fù)雜關(guān)系,在促進宿主生長、維護和提高宿主免疫、生物頡頏及穩(wěn)定宿主胃腸道的微生態(tài)環(huán)境等方面起著重要的作用(Yamazaki等,1985;Suskovie等,2001)。Langendijk等(1995)首次采用探針Bif164,通過熒光原位雜交方法對人體腸道內(nèi)的雙歧桿菌進行定量分析,并與傳統(tǒng)的平板稀釋計數(shù)法進行了比較,結(jié)果顯示兩種方法差異不顯著,并證明糞便中的所有雙歧桿菌都是可厭氧培養(yǎng)的。修淑麗等(2000)用雙歧桿菌16SrRNAV2區(qū)的屬特異性寡核苷酸作為探針,標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC),成功地將8株雙歧桿菌與腸道其他常見菌區(qū)別開來,該結(jié)果與地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針菌落雜交的結(jié)果一致,進一步說明熒光原位雜交法可用于雙歧桿菌的鑒定。鐘燕等(2003)用5種探針分析了人的結(jié)腸菌群,試驗結(jié)果表明,熒光原位雜交技術(shù)分析糞便樣本中的菌群具有較好的穩(wěn)定性和有效性,與細(xì)菌培養(yǎng)法的結(jié)果一致,并發(fā)現(xiàn)結(jié)腸細(xì)菌總數(shù)和雙歧桿菌數(shù)可能與乳糖不耐受癥狀的產(chǎn)生有關(guān)。Takada等(2004)對3種熒光基團進行不同組合,用7種針對雙歧桿菌的探針染上不同顏色的熒光,成功地運用多彩熒光原位雜交的方法分析成人糞便中常見的7種雙歧桿菌,這為以后分析雙歧桿菌的屬內(nèi)群落特點提供了方法。Rinne等(2005)采用熒光原位雜交技術(shù)和PCR技術(shù),對母乳喂養(yǎng)的嬰兒與非母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道雙歧桿菌的差別進行了研究,結(jié)果表明,不同的飲食結(jié)構(gòu)對6個月左右嬰兒的腸道內(nèi)雙歧桿菌造成了顯著影響。Dinoto等(2006)將熒光原位雜交技術(shù)與流式細(xì)胞儀相結(jié)合,首次研究了人食用棉籽糖時糞便中雙歧桿菌的菌群動態(tài),結(jié)果表明,人在服用棉籽糖前,腸道中雙歧桿菌占腸道總菌數(shù)的百分比為12.5%,食用2周和4周后分別上升到28.7%和37.2%,停止服用棉籽糖4周后,雙歧桿菌數(shù)量又恢復(fù)到初始水平。由于哺乳期反芻動物胃腸道微生物區(qū)系的發(fā)育與雙歧桿菌有著密切的聯(lián)系,熒光原位雜交技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于反芻動物胃腸道微生物區(qū)系的研究,尤其是犢牛和羔羊腸道中微生物的定量檢測。VLKOVá等(2006)應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)計數(shù)犢牛腸道中的雙歧桿菌,并且與培養(yǎng)計數(shù)進行比較,試驗結(jié)果表明,熒光原位雜交技術(shù)的計數(shù)結(jié)果比傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)更為精確。2.2細(xì)菌計數(shù)檢測Franks等(1998)針對人腸道中的厭氧優(yōu)勢菌群,包括脆弱擬桿菌、吉氏擬桿菌、溶組織梭菌、象牙海岸梭菌、球形梭菌、直腸真桿菌、鏈球菌屬和乳球菌屬,設(shè)計了不同的16SrRNA寡核苷酸探針,通過熒光原位雜交方法進行了定量,結(jié)果表明,通過不同的探針組合可以檢測到糞便中約2/3的菌群。Harmsen等(2002)用6種探針檢測了韋榮球菌屬、霍氏真桿菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬等6種腸道厭氧微生物。Schwiertz等(2000)在研究人糞便中真桿菌屬時,分別對真桿菌屬中的10種真桿菌設(shè)計了11種特異性16SrRNA探針,用這些探針直接檢測到人糞便中的5種真桿菌,獲得了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。這些探針具有高度的特異性,其靈敏度為107/g(干重)。Zoetendal等(2002)設(shè)計了瘤胃球菌的靶16SrRNA寡核苷酸探針,同時采用熒光原位雜交技術(shù)與流式細(xì)胞進行細(xì)菌計數(shù),結(jié)果顯示,熒光顯微鏡計數(shù)與流式細(xì)胞儀計數(shù)的結(jié)果無顯著差別,同時發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌在數(shù)量上顯示了顯著的寄主專一性。孫福春等(2007)通過熒光原位雜交技術(shù)對人類腸道微生態(tài)體系中20個以上的優(yōu)勢菌群進行了計數(shù)。3srrna探針原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)是1989年在已有的放射性原位雜交技術(shù)上發(fā)展起來的一種非放射性技術(shù),距今只有近20年的時間,因此存在一些不足之處。首先,探針的設(shè)計和操作技術(shù)有待進一步發(fā)展和完善。熒光原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵是特異性16SrRNA探針的設(shè)計,要設(shè)計出高度特異和敏感的探針,就要知道微生物的全部16SrRNA基因序列,然后根據(jù)探針的特異性水平選擇不同的特異性片段,從目前16SrRNA基因測序研究進展來看,已經(jīng)測出2000多種微生物的16SrRNA基因序列,還有很多微生物的16SrRNA基因序列未知,說明在現(xiàn)階段16SrRNA探針原位雜交方法還不能完全替代傳統(tǒng)的研究方法;其次,熒光原位雜交技術(shù)也受到熒光檢測的限制。熒光染料的自我衰減、目標(biāo)微生物由于營養(yǎng)貧脊而導(dǎo)致的減少,和樣品中熒光自猝滅現(xiàn)象等(Margo等,1985)也會影響熒光原位雜交技術(shù)的結(jié)果;最后,目前的熒光原位雜交技術(shù)還停留在熒光顯微鏡下人工計數(shù)的階段,雜交細(xì)胞的數(shù)量僅限于幾