臨床生化干擾實(shí)驗(yàn)批準(zhǔn)指南(EP7-A)廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科徐建華目的

為臨床生化檢驗(yàn)結(jié)果中研究、鑒別和確定干擾物質(zhì)效應(yīng)提供背景信息、指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)程序

專門為廠商和臨床實(shí)驗(yàn)室制訂

作用

對(duì)廠商來(lái)說(shuō)，通過(guò)EP7程序可以篩選潛在干擾物質(zhì)，量化干擾效應(yīng)，證實(shí)病人樣本中的干擾，確認(rèn)分析方法對(duì)干擾物質(zhì)的敏感性，評(píng)估潛在的風(fēng)險(xiǎn)，并將有意義的干擾聲明提供給用戶。對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，通過(guò)EP7的調(diào)查策略，規(guī)定數(shù)據(jù)收集和分析要求，確認(rèn)干擾聲明，研究明確的干擾物質(zhì)帶來(lái)的結(jié)果差異，確保分析方法符合臨床要求。主要內(nèi)容干擾相關(guān)概念與理論適用范圍干擾實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)干擾分析前的質(zhì)量保證干擾測(cè)定用病人標(biāo)本評(píng)價(jià)干擾建立、確認(rèn)和驗(yàn)證干擾聲明調(diào)查分析與臨床不一致的病人結(jié)果術(shù)語(yǔ)分析物(Analyte)：實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的物質(zhì)或者成分干擾物（Interferent)：樣本中不同于分析物并能引起測(cè)量偏倚的成分干擾：在臨床生化中，由于另一成分影響或樣本的特性，待測(cè)一定濃度的被分析物出現(xiàn)有臨床意義的偏倚干擾標(biāo)準(zhǔn)：干擾物所允許的最大結(jié)果偏倚干擾敏感度：某一分析方法對(duì)來(lái)自其他成分或者樣本特性的干擾引起誤差的敏感性

術(shù)語(yǔ)干擾聲明：一種物質(zhì)影響分析方法結(jié)果效應(yīng)的陳述干擾篩選：分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)中，利用高濃度樣品進(jìn)行一系列能鑒別有可能發(fā)生干擾的物質(zhì)差異結(jié)果//異常結(jié)果//假性結(jié)果（Discrepantresult//Anomalousresults//Spuriousresults)：一種與臨床不一致的結(jié)果，或同一標(biāo)本的另一個(gè)不同結(jié)果，或與其他方法不同結(jié)果，或與已確定的臨床診斷不相符的結(jié)果

術(shù)語(yǔ)內(nèi)源性干擾：樣本中的一些生理物質(zhì)（例如膽紅素、血紅蛋白），可對(duì)另一些物質(zhì)分析時(shí)引起干擾。外源性干擾：一種源自體外的物質(zhì)（例如，藥物或其代謝物，防腐劑，污染物），可對(duì)樣本中另一物質(zhì)的分析引起干擾。術(shù)語(yǔ)驗(yàn)證（validation）：通過(guò)調(diào)查及提供客觀證據(jù)，證實(shí)可以滿足某期望用途的特定要求。(users’requirementshavebeenmet(e.g.,accuracyrequirementsforpatients’results)確認(rèn)(verification)：通過(guò)調(diào)查及提供客觀證據(jù),確認(rèn)滿足了特定的要求。(specifiedcriteriahavebeenmet(e.g.,interferencecriteriaorinterferenceclaims)適用范圍1.適用大部分析方法和儀器，特殊方法可能需要必要的調(diào)整，如分離技術(shù)和免疫學(xué)分析方法在附錄A中被討論。2.血清、血漿、全血、腦脊液、尿和其它大多數(shù)體液等標(biāo)本類型都可用本指南評(píng)估3.適用以下干擾物質(zhì)：

病理情況下的代謝物，如膽紅素、脂肪、蛋白質(zhì)、血紅蛋白等；病人治療期間引入的物質(zhì)，如藥物、腸外營(yíng)養(yǎng)、血漿代用品、抗凝劑等；病人吸收的物質(zhì)，如藥品濫用、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充等；標(biāo)本準(zhǔn)備引入的物質(zhì)，如抗凝劑、防腐劑等；標(biāo)本處理過(guò)程中引入的污染物，如手霜、滑石粉、促凝劑等；標(biāo)本自身的基質(zhì)效應(yīng)，其理化性質(zhì)跟理想的新鮮標(biāo)本不同。適用范圍1.干擾對(duì)不準(zhǔn)確度的影響

不準(zhǔn)確度（總分析誤差）包括不精密度、方法特異性偏倚和樣本特異性偏倚（干擾），對(duì)干擾物質(zhì)的敏感性可以引起系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。基本概念2.分析前效應(yīng)

分析前分析物或者它的濃度的改變通常稱為“分析前效應(yīng)”，這些作用可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床應(yīng)用，但不能視作“分析干擾”。這些作用：體內(nèi)藥物作用，如使用藥物后因生理響應(yīng)使激素濃度變化標(biāo)本處理，由于蒸發(fā)、溶血或者血清長(zhǎng)時(shí)間不分離使電解質(zhì)、蛋白、水含量改變標(biāo)本收集，如在靜脈滴注時(shí)（內(nèi)含分析物）取樣

基本概念3.絕對(duì)干擾與相對(duì)干擾

干擾作用可看成是絕對(duì)的或相對(duì)的絕對(duì)干擾：一般病人標(biāo)本中含有某物質(zhì)，一旦它的存在即會(huì)引起干擾。相對(duì)干擾：一般病人標(biāo)本中含有某物質(zhì)，其含量相對(duì)于混合樣品中的平均濃度，不同病人樣品中含有該物質(zhì)的濃度變化引起干擾作用的變化，相對(duì)干擾作用在臨床實(shí)驗(yàn)中更有意義。基本概念基本概念

相對(duì)干擾一些方法可以校正干擾物的平均濃度做補(bǔ)償，以使病人標(biāo)本中的干擾效應(yīng)減小到最低，有代表性的方法包括樣品前處理、設(shè)置空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)血清校準(zhǔn)和數(shù)學(xué)校正，當(dāng)干擾物的濃度大于或者小于病人樣本中的平均濃度時(shí)將引起誤差?；靖拍?.干擾機(jī)制由于某干擾物的存在以多種方式影響分析過(guò)程，主要機(jī)制：物理作用干擾物具有的物理性質(zhì)，使它與分析物一樣被檢測(cè)出來(lái)，如顏色、光散射（光吸收）、洗脫位置、電極響應(yīng)等。干擾物可能會(huì)改變標(biāo)本的物理特性，如表面張力、黏度、濁度、離子強(qiáng)度等，干擾檢測(cè)結(jié)果?；靖拍罡蓴_機(jī)制化學(xué)作用

干擾物可能會(huì)影響酶活力，例如，阻止金屬激活劑結(jié)合到活性中心上去，氧化必須的巰基等。干擾物也可破壞或阻止反應(yīng)，例如，破壞試劑或抑止指示反應(yīng)。干擾物也可改變分析物的形式，例如，形成復(fù)合物或沉淀?；靖拍?.干擾機(jī)制非特異性干擾物可能和分析物以同樣的方式參與反應(yīng)，例如，苦味酸肌酐方法中酮酸干擾，重氮膽紅素方法重吲哚酚硫酸鹽的干擾。在免疫化學(xué)方法中干擾物和抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。例如，茶堿方法中咖啡因的干擾?；靖拍?.干擾機(jī)制水取代作用非水物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)），由于取代了血漿中部分水體積，影響了一些分析物的測(cè)定。這些作用考慮或不考慮為干擾作用，取決于要求的結(jié)果是以總體積的濃度表示，還是以血漿水的濃度來(lái)表示。干擾實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)

為保證客觀性，可接受標(biāo)準(zhǔn)必須在評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)操作之前就確定。建立可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，必須考慮臨床意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義兩者之間的差別。1.臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)基于生理變異源于臨床經(jīng)驗(yàn)基于被分析物變異干擾實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)

2.統(tǒng)計(jì)學(xué)意義在確定一個(gè)物質(zhì)是否存在干擾前，首先確定所得到的結(jié)果是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.分析物檢測(cè)濃度干擾應(yīng)該在兩種醫(yī)學(xué)決定濃度被評(píng)估，如果在一種濃度上進(jìn)行測(cè)試，要注意有可能漏過(guò)在其他分析物濃度水平上有臨床意義的干擾。干擾實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)

干擾實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)4.干擾物檢測(cè)濃度決定一種物質(zhì)在“最壞情況”的條件下是否會(huì)產(chǎn)生干擾，干擾篩選應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室期望觀察到的最高濃度水平的病人樣本中進(jìn)行。5.潛在的干擾物質(zhì)干擾分析前的質(zhì)量保證在進(jìn)行一個(gè)干擾實(shí)驗(yàn)之前，必須進(jìn)行：培訓(xùn)和熟悉精密度確認(rèn)--EP5《臨床生化設(shè)備性能的精密度評(píng)價(jià)》準(zhǔn)確度確認(rèn)--EP9《利用病人樣本進(jìn)行方法學(xué)比較和偏倚評(píng)估》攜帶污染評(píng)價(jià)質(zhì)量控制--C24《內(nèi)部質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)：原理和定義》標(biāo)準(zhǔn)化防范—M29《實(shí)驗(yàn)室工作人員避免職業(yè)感染》安全性和廢物處置--參照廠商的標(biāo)簽和材料安全數(shù)據(jù)表（MSDS）干擾測(cè)定（Determinationofinterferencecharacteristics)第一種方法：評(píng)價(jià)潛在的干擾物添加到樣本后的干擾效應(yīng)（干擾篩選）第二種方法：評(píng)價(jià)個(gè)別有代表性的病人結(jié)果與高特異性的比較方法的結(jié)果偏倚（用病人標(biāo)本評(píng)價(jià)干擾）干擾篩選

將陽(yáng)性干擾物加入測(cè)定樣品中，與不加的對(duì)照組比較有無(wú)偏移，稱為“配對(duì)差異”實(shí)驗(yàn)。一般最有效的方法是在較高濃度下對(duì)系列可能的干擾物作初步篩選，如果臨床顯著意義，則該物質(zhì)不是干擾物，無(wú)須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。反之，具有臨床顯著意義的，應(yīng)進(jìn)一步評(píng)價(jià)以確定干擾物濃度與干擾程度間的關(guān)系，這類實(shí)驗(yàn)稱為“劑量效應(yīng)”（dose－response）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.測(cè)試組和對(duì)照組在同一個(gè)分析批內(nèi)完成；2.計(jì)算重復(fù)測(cè)量次數(shù)：有臨床意義的最小差異值；假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)；重復(fù)性（批內(nèi)精密度）。實(shí)驗(yàn)材料

1基礎(chǔ)標(biāo)本（Basepool）

從幾個(gè)健康的、沒(méi)有進(jìn)行藥物治療的個(gè)體獲得適當(dāng)類型（血清、尿等）的新鮮樣本，基礎(chǔ)樣本應(yīng)能反映樣本基質(zhì)，能反映分析物的特點(diǎn)。合適的冰凍或凍干樣本，確認(rèn)測(cè)試材料是否與臨床樣本相似計(jì)算所需樣本量

測(cè)定基礎(chǔ)標(biāo)本中分析物的濃度并用合適的純物質(zhì)調(diào)整測(cè)試管的分析物濃度到醫(yī)學(xué)決定濃度，應(yīng)避免加入分析物時(shí)引入其他物質(zhì)，推薦的分析物測(cè)試濃度見附錄B。實(shí)驗(yàn)材料2.貯存液獲得合適而純的潛在干擾物，或者該物質(zhì)最接近體內(nèi)循環(huán)狀態(tài)的形式選擇一種能夠充分溶解分析物的溶劑

盡可能小地稀釋樣本基質(zhì)，最好小于5%。如果溶解度允許，通常配制成濃縮的20倍的貯存溶液有機(jī)溶劑需要特殊的對(duì)待，氯仿至少要求1：100的稀釋倍數(shù)，乙醇濃度大于1～2％時(shí)能夠使抗體變性。3.對(duì)照樣本用制備貯存液相同體積的溶劑替代測(cè)試干擾物，其他要求與測(cè)試樣本相同。如果對(duì)照樣本中存在測(cè)試物質(zhì)（比如膽紅素），使用合適的分析方法確定它的濃度。如果對(duì)照樣本中被分析物濃度與基礎(chǔ)樣本中明顯的不相符，考慮溶劑為潛在的干擾物。實(shí)驗(yàn)材料重測(cè)次數(shù)要求重測(cè)次數(shù)取決于統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)水準(zhǔn)當(dāng)有效假設(shè)檢驗(yàn)不能確定干擾的方向（正的或負(fù)的）時(shí)使用雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)有效假設(shè)檢驗(yàn)包括干擾的方向（正的或負(fù)的）時(shí)使用單側(cè)檢驗(yàn)重測(cè)次數(shù)要求雙側(cè)檢驗(yàn)：Z1-

/2：100(1－?)%的置信水平，z1－?：100（1－?）％檢驗(yàn)效能，s是重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差。dmax是分析物在測(cè)試濃度范圍內(nèi)的最大允許干擾。單側(cè)檢驗(yàn)：

用Z1-

代替Z1-

/2

z百分位值：重測(cè)次數(shù)要求

z百分位值：舉例：檢測(cè)可接受干擾程度為1.5mg/dL的干擾效應(yīng)，95％（

＝0.05）檢驗(yàn)水準(zhǔn)時(shí)，重復(fù)性（批內(nèi)精密度）為1.0mg/dL,計(jì)算重復(fù)次數(shù)：重測(cè)次數(shù)要求批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（dmax/s）的倍數(shù)：

95％（

＝0.05）檢驗(yàn)水準(zhǔn)時(shí)檢測(cè)不同的干擾效應(yīng)所需的重測(cè)次數(shù)如下：

重測(cè)次數(shù)要求批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（dmax/s）的倍數(shù)：舉例在1mg/dL肌酐濃度水平，批內(nèi)重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差為0.075mg/dL，實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為0.1mg/dL是一個(gè)有意義的干擾。需要測(cè)定多少次，可能干擾能被檢測(cè)到？首先，把不精確度表述為批內(nèi)重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差的倍數(shù)：0.1mg/dL/0.075mg/dL=1.33。將1.33向前舍入一位為1.3，上表決定重復(fù)測(cè)定次數(shù)，得出在95％（

＝0.05）檢驗(yàn)水準(zhǔn)時(shí)，每個(gè)對(duì)照和測(cè)試樣品需要重復(fù)測(cè)定16次。重測(cè)次數(shù)要求實(shí)驗(yàn)程序

“配對(duì)差異”實(shí)驗(yàn)：

1)合適的分析物濃度；2)建立有臨床意義差別的標(biāo)準(zhǔn)（dmax）；3)確定每個(gè)樣品所需的重復(fù)測(cè)量次數(shù)；4)準(zhǔn)備臨床基礎(chǔ)標(biāo)本；5)準(zhǔn)備20倍的濃縮貯存液（潛在干擾物），如果使用另外一種濃度）確定，按照步驟6和8稀釋（推薦濃度見附表C）;6)用吸管吸取1/20容器體積的濃縮貯存液到容量瓶中，稱為測(cè)試樣品，7)用基礎(chǔ)液補(bǔ)足到刻度體積，充分混勻；8)用吸管吸取1/20容器體積的制備貯存液的溶劑到第二個(gè)容量瓶，稱為對(duì)照樣品。9)基礎(chǔ)液補(bǔ)足體積，充分混勻；10)準(zhǔn)備能夠被n整除的測(cè)試樣本和對(duì)照樣本，重復(fù)測(cè)定次數(shù)n由第三步確定；實(shí)驗(yàn)程序

11)按交互的順序分析測(cè)試（T）和對(duì)照（C）樣本；如果檢測(cè)系統(tǒng)受攜帶污染影響，增加額外的樣本使對(duì)照樣本免受來(lái)自測(cè)試樣本攜帶污染的影響。增加的額外對(duì)照樣品Cx結(jié)果應(yīng)舍棄。12)記錄結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)程序

數(shù)據(jù)分析.1

計(jì)算觀察到的干擾效應(yīng)的“點(diǎn)估計(jì)”，即dobs，是測(cè)試樣本均值和對(duì)照樣本均值之間的差值。2計(jì)算cut-off值ｄc（雙側(cè)檢驗(yàn)）ｄnull是無(wú)效假設(shè)規(guī)定的值，通常＝0，對(duì)于單側(cè)檢驗(yàn)，用Z1－

取代Z1－

/2。3.計(jì)算95％置信區(qū)間的干擾效應(yīng)95％置信區(qū)間＝數(shù)據(jù)分析s是測(cè)量方法重復(fù)性的批內(nèi)精密度，n是每個(gè)樣本的重復(fù)測(cè)量次數(shù)，t0.975n-1為t檢驗(yàn)數(shù)值表中97.5%和n-1的自由度時(shí)的值（n>30，2.0是t0.975n-1的合理近似值）。結(jié)果解釋如果點(diǎn)估計(jì)dobs值小于或等于cut-off值dc，可以得出某種物質(zhì)引起的偏倚小于dmax；否則，接受有效假設(shè)，說(shuō)明由該物質(zhì)引起干擾的假設(shè)成立。當(dāng)解釋干擾測(cè)試結(jié)果時(shí)考慮以下情況：由于吸樣錯(cuò)誤，真實(shí)的干擾可能不同于觀察到的“點(diǎn)估計(jì)”。如果無(wú)效假設(shè)成立，置信限100（1－

）％接受它；如果有效假設(shè)檢驗(yàn)成立，置信限100（1－?）％接受它。相反置信限分別為100

％和100?％。如果被檢物為非人血清成分檢測(cè)，可能會(huì)引入人造物品的誤差測(cè)試濃度的隨意選擇可能不顯示干擾結(jié)果解釋當(dāng)一種或多種分析物的濃度出現(xiàn)干擾效應(yīng)，則可通過(guò)劑量效應(yīng)曲線確定不同干擾物濃度干擾程度，干擾物不同濃度可通過(guò)最高值干擾物濃度樣本和對(duì)照樣本混合制備。一般情況下，做劑量效應(yīng)曲線時(shí)每個(gè)測(cè)試濃度水平重復(fù)測(cè)量三次足夠。如計(jì)算每個(gè)濃度所需的重復(fù)測(cè)量次數(shù)，也可用附錄中公式計(jì)算。“劑量效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)測(cè)試材料1.基礎(chǔ)標(biāo)本2.貯存液3.高濃度樣本---用基礎(chǔ)標(biāo)本稀釋貯存液，制備成所需的濃度。4.低濃度樣本準(zhǔn)備一組低的含平均濃度的干擾物的臨床樣本，在大多數(shù)情況下，治療藥物，或血紅蛋白、膽紅素可以忽略不計(jì)，低濃度樣本的制備可參照對(duì)照樣本的制備方法測(cè)試材料5.測(cè)試樣本---制備一系列不同濃度的干擾測(cè)試樣本，通常五個(gè)濃度足夠確定一個(gè)線性的劑量效應(yīng)關(guān)系。劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)程序

1)測(cè)定待測(cè)的最高和最低標(biāo)本濃度水平；2)確定被認(rèn)為“有臨床意義”差別，如果曾做過(guò)“配對(duì)差異”實(shí)驗(yàn)，這一步已經(jīng)完成；3)確定在每個(gè)濃度重測(cè)次數(shù)n（見附錄E），通常3次；4)準(zhǔn)備高中低系列濃度樣本；劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)程序

5）按照第三步n值的大小準(zhǔn)備每份標(biāo)本量；6）在同一分析批之內(nèi)檢測(cè)5個(gè)樣本的濃度，第一組按照升序測(cè)定各樣本，第二組按降序測(cè)定，第3組按照升序等等，平均系統(tǒng)漂移影響；或按隨機(jī)順序檢測(cè)所有樣本，達(dá)到最小化漂移效應(yīng)；7）計(jì)算低濃度樣本的平均值，其他各組結(jié)果中減去該低濃度樣本的平均值，然后把最終凈結(jié)果填入表格中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析將結(jié)果點(diǎn)在圖上，y軸為干擾結(jié)果，x軸上為干擾物濃度，觀察劑量效應(yīng)關(guān)系曲線的形狀：

線性效應(yīng)非線性效應(yīng)線性效應(yīng)

數(shù)據(jù)隨機(jī)分布，大約成一條直線，用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，在圖上劃出回歸直線，確定適合所有數(shù)據(jù)點(diǎn)，其效應(yīng)曲線是線性。與干擾物濃度相關(guān)線性干擾舉例：線性效應(yīng)

五個(gè)濃度水平的劑量效應(yīng)線性關(guān)系結(jié)果線性效應(yīng)

劑量效應(yīng)回歸分析線性效應(yīng)

線形回歸的95%可信區(qū)間范圍從干擾物濃度與置信區(qū)間改變大小的函數(shù)可以看出，在95%置信區(qū)間內(nèi)結(jié)果最可信的是中間干擾物濃度范圍

非線性效應(yīng)干擾物濃度的干擾可能不是一個(gè)線性函數(shù)，如果繪圖的數(shù)據(jù)顯示是彎曲的，那么對(duì)一個(gè)給定的干擾物濃度的干擾程度的適當(dāng)估計(jì)可以用圖解形式表示。舉例：