微生物、含水量和cd對(duì)土壤中大腸桿菌降解動(dòng)態(tài)的影響

氨基丙烯酸苯二甲酯的化學(xué)名稱(chēng)為苯二氯二甲酯。這是一種高效、低毒的內(nèi)毒劑。20世紀(jì)70年代中期，它迅速取代了有機(jī)硫菌和有機(jī)硫菌。它被廣泛應(yīng)用于水稻、棉花、蔬菜、果樹(shù)和醫(yī)藥等由半知菌和多囊菌等細(xì)菌引起的疾病的預(yù)防和處理。同時(shí)，許多苯丙烯酸酯農(nóng)藥的主要解釋產(chǎn)物和有效組成。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,多菌靈通常是重復(fù)多次使用,特別是在設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過(guò)程中,由于病害多發(fā)、高發(fā),多菌靈使用量大且施用頻率高.多菌靈可從土壤中或直接噴灑進(jìn)入蔬菜和作物體內(nèi),并且在動(dòng)物飼料中廣泛使用,通過(guò)動(dòng)物體進(jìn)入人體而導(dǎo)致組織病變.已有研究表明,多菌靈能夠干擾哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌,并對(duì)精母細(xì)胞的減數(shù)分裂產(chǎn)生影響.施入土壤中的農(nóng)藥和除草劑在土壤中的降解和殘留除與本身的性質(zhì)有關(guān)外,還與土壤理化性質(zhì)、土壤微生物和環(huán)境因子有密切的關(guān)系.多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在土壤中的降解半衰期與土壤類(lèi)型和初始濃度有關(guān),為幾天到幾個(gè)月不等.土壤中存在著的豐富的微生物群落,對(duì)土壤中多菌靈的降解發(fā)揮了重要作用,農(nóng)藥的微生物分解是其在環(huán)境中降解消除的一個(gè)重要途徑.目前已報(bào)道的多菌靈降解菌有假單胞菌Pseudomonassp.、芽孢桿菌Bacilluspumilus、紅球菌Rhodococcussp.、羅爾斯通氏菌Ralstoniasp.和木霉菌株Trichondermasp..但是,目前關(guān)于功能菌群降解土壤中多菌靈的研究還比較少.改變土壤環(huán)境,選擇有利于多菌靈降解的環(huán)境條件是促進(jìn)多菌靈的降解,縮短其在土壤中滯留期的行之有效的方法.多菌靈在土壤中的降解速率隨著土壤pH值升高而增加.但是,針對(duì)大范圍的土壤,pH等環(huán)境條件不易改變,而含水量較易調(diào)控.目前并未有報(bào)道指明含水量是如何影響土壤中多菌靈降解的.由于農(nóng)田土壤中農(nóng)藥大量施用以及污水、污泥灌溉的廣泛應(yīng)用,多菌靈和Cd復(fù)合污染越來(lái)越嚴(yán)重,污染土壤的范圍越來(lái)越廣,研究Cd對(duì)多菌靈降解的影響迫在眉睫.本研究利用高效液相色譜分析技術(shù),在分析不同土壤中多菌靈降解動(dòng)態(tài)變化的基礎(chǔ)上,闡明了土著微生物、降解菌群、土壤含水量以及Cd對(duì)多菌靈降解的影響,以期為進(jìn)一步降低其在土壤中的殘留提供依據(jù).1材料和方法1.1反應(yīng)試劑和設(shè)備1.1.1實(shí)驗(yàn)所需溶液甲醇為HPLC級(jí),多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.5%)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所,實(shí)驗(yàn)所需溶液均由MilliporeMilli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó))出水(18.2MΩ)配制.1.1.2儀器、試藥和儀器Agilent1200液相色譜儀;LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);HZ-9211K型控溫振蕩器(太倉(cāng)市科教器材廠);BUCHIR200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;超聲萃取儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);YXQ-LS-50高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);減壓抽濾裝置(鞏義市英峪予華儀器廠);BYKFD-1冷凍干燥機(jī);MilliporeMilli-Q超純水系統(tǒng)等.1.2土壤理化性質(zhì)的測(cè)定采集浙江大學(xué)華家池校區(qū)試驗(yàn)田0~20cm的新鮮土樣,土樣經(jīng)風(fēng)干,除去植物殘根和石礫等雜物,過(guò)2mm篩備用.試驗(yàn)田沒(méi)有多菌靈的用藥歷史,土壤的理化性質(zhì)見(jiàn)表1.1.3菌種和菌懸液的制備本實(shí)驗(yàn)選用浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所分離的多菌靈降解菌來(lái)研究其對(duì)多菌靈降解動(dòng)態(tài)的影響.該降解菌為復(fù)合菌群,其中四大優(yōu)勢(shì)菌分別為枯草桿菌Bacillussubtilis、副球菌Paracoccussp.、黃桿菌Flavobacterium和假單胞菌Pseudomonassp.CBW.此復(fù)合菌能利用多菌靈為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng),在5d內(nèi)對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)的多菌靈(10mg·L-1)的降解率達(dá)到99.6%.菌懸液的制備為將多菌靈降解菌接種在LB液體培養(yǎng)基中,在30℃,200r·min-1搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,4000r·min-1離心收集菌體并用磷酸緩沖液洗滌3次,再用磷酸緩沖液重懸菌體至所需濃度.1.4hplc檢測(cè)稱(chēng)取5g土樣于100mL具塞三角瓶中,加入20mL甲醇振蕩2h,超聲30min,用布氏漏斗抽濾,再用5mL甲醇洗滌殘?jiān)?次,合并濾液于250mL旋蒸瓶中,置于50℃水浴上濃縮至近干,用甲醇定容至5mL,待HPLC檢測(cè).HPLC檢測(cè)條件:EclipseXDB-C18柱[4.6mm(id)×150mm],粒徑5μm;流動(dòng)相:甲醇∶水(35∶65);流速:0.8mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):281nm;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:室溫;多菌靈保留時(shí)間約2.7min.多菌靈添加回收率:為了檢測(cè)土壤樣品中多菌靈提取方法的可靠性,向無(wú)多菌靈的土樣中分別添加1.0和10mg·kg-1的多菌靈,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù),同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn),測(cè)定多菌靈的回收率.回收率=加標(biāo)試樣測(cè)定值/加標(biāo)量×100%.1.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.5.1滅活降解菌劑土的制備稱(chēng)取150g干土于塑料盆中,土壤中多菌靈的添加濃度為低濃度(5.0mg·kg-1)和高濃度(10.0mg·kg-1),每個(gè)濃度設(shè)置3組,分別為:①滅菌土;②非滅菌土,加入滅活降解菌劑;③非滅菌土,加入降解菌劑.滅菌土壤需在121℃,1.1kg·cm-2壓力下間歇滅菌3次,每次滅菌30min,降解菌劑的加入量為108CFU·g-1,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).加入適量無(wú)菌水,使土壤含水量為田間持水量的60%,用開(kāi)有內(nèi)徑1mm的5個(gè)小孔的錫箔紙覆蓋塑料盆,于人工氣候箱(25±1)℃黑暗培養(yǎng),培養(yǎng)土壤期間每天調(diào)節(jié)水分,使土壤含水量保持恒定,藥劑處理后1、3、7、14、21和28d取樣測(cè)定土壤中多菌靈的殘留量.1.5.2土壤持水率的測(cè)定在2個(gè)濃度多菌靈(5.0mg·kg-1和10.0mg·kg-1)的土壤中,各加入一定的水分,調(diào)節(jié)土壤含水量分別為田間持水量的40%、60%和80%,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).用開(kāi)有內(nèi)徑1mm的5個(gè)小孔的錫箔紙覆蓋塑料盆,于人工氣候箱(25±1)℃黑暗培養(yǎng),其余步驟同1.5.1節(jié).1.5.3cd添加濃度在2個(gè)濃度多菌靈(5.0mg·kg-1和10.0mg·kg-1)的土壤中,按照添加Cd的濃度以及是否加入有活性的多菌靈降解菌設(shè)置為6組,分別為:①Cd本底,無(wú)外源添加Cd,加入滅活降解菌;②土壤中Cd添加濃度為5.0mg·kg-1,加入滅活降解菌;③土壤中Cd添加濃度為50.0mg·kg-1,加入滅活降解菌;④Cd本底,無(wú)外源添加Cd,加入多菌靈降解菌;⑤土壤中Cd添加濃度為5.0mg·kg-1,加入多菌靈降解菌;⑥土壤中Cd添加濃度為50.0mg·kg-1,加入多菌靈降解菌.加入適量無(wú)菌水,使土壤含水量為田間最大持水量的60%,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).用開(kāi)有內(nèi)徑1mm的5個(gè)小孔的錫箔紙覆蓋塑料盆,于人工氣候箱(25±1)℃黑暗培養(yǎng),其余步驟同1.5.1節(jié).2結(jié)果與分析2.1添加回收率和檢測(cè)限多菌靈在土壤中的平均添加回收率和變異系數(shù)見(jiàn)表2.多菌靈在土壤中的添加濃度分別為1.0mg·kg-1和10.0mg·kg-1,測(cè)得的平均添加回收率為86.1%~92.5%,變異系數(shù)為2.4%~2.9%,最低檢測(cè)限為0.1mg·kg-1,數(shù)據(jù)表明土壤中多菌靈的提取方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求.2.2對(duì)細(xì)菌的降解滅菌、非滅菌(加滅活降解菌)和非滅菌(加降解菌)土壤中多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)的降解特征如圖1所示,滅菌土壤中多菌靈降解非常緩慢,非滅菌土壤中的多菌靈降解明顯快于滅菌土壤,而且添加多菌靈降解菌會(huì)促進(jìn)多菌靈的降解.處理28d后,低濃度3個(gè)處理土壤中多菌靈的降解率分別為19.4%、76.6%和87.6%,高濃度3個(gè)處理土壤中多菌靈的降解率分別為16.7%、60.9%和71.4%.多菌靈在土壤中前期降解較快,后期降解較慢,對(duì)圖1中多菌靈的降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行回歸分析表明,多菌靈的降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程c=c0e-kt.滅菌條件下,多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)降解半衰期為非滅菌(加滅活降解菌)的12.6~13.8倍.加入有活性的多菌靈降解菌之后,多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)降解半衰期與加滅活降解菌的處理比較,分別縮短了37.1%和32.1%,降解菌顯著地加快了土壤中多菌靈的降解.2.3不同含水量對(duì)真菌降解的影響在含水量分別為40%、60%和80%田間持水量的土壤中多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)的降解特征如圖2所示.28d后,3個(gè)不同含水量的土壤中,多菌靈(5.0mg·kg-1)的降解率分別為63.0%、76.7%和95.0%,并且多菌靈(10.0mg·kg-1)的降解率分別為54.4%、60.9%和70.6%,隨著含水量的提高,2個(gè)濃度的多菌靈在土壤中的降解速度均加快.對(duì)圖2中多菌靈的降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行回歸分析表明,多菌靈的降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程c=c0e-kt.在含水量分別為40%、60%和80%田間持水量的土壤中,隨著含水量的提高,土壤中多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)的降解半衰期分別降低了74.0%和46.2%.由此可以得出,在一定的土壤濕度范圍內(nèi),隨著濕度增高,多菌靈在土壤中的降解速度加快.2.4cd對(duì)介質(zhì)對(duì)動(dòng)物降解的影響在添加不同濃度Cd(0、5和50mg·kg-1)的土壤中多菌靈的降解特征如圖3所示.28d后,在添加滅活降解菌、不同濃度Cd(0、5和50mg·kg-1)的土壤中,多菌靈(5mg·kg-1)的降解率分別為76.6%、92.4%和52.9%,多菌靈(10.0mg·kg-1)的降解率分別為61.0%、71.7%和42.2%,土壤中加入有活性的多菌靈降解菌后,在不同濃度Cd(0、5和50mg·kg-1)的土壤中,多菌靈(5mg·kg-1)的降解率分別為87.5%、97.4%和64.8%,多菌靈(10.0mg·kg-1)的降解率分別為71.4%、82.7%和56.0%.表明低濃度的Cd(5.0mg·kg-1)促進(jìn)多菌靈的降解,而高濃度的Cd(50.0mg·kg-1)抑制多菌靈的降解.對(duì)圖3中多菌靈的降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行回歸分析表明,多菌靈的降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程c=c0e-kt.在加入滅活降解菌的土壤中,Cd5處理與未添加Cd的處理相比,多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)降解半衰期分別縮短了52.4%和32.1%,但是Cd50處理中多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)降解半衰期比未添加Cd的處理分別增加了103.0%和92.6%.在加入有活性的多菌靈降解菌的土壤中,Cd5處理與未添加Cd的處理相比,多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)降解半衰期分別縮短了34.4%和34.0%,但是Cd50處理中多菌靈(5mg·kg-1和10mg·kg-1)降解半衰期比未添加Cd的處理分別增加了109.4%和74.4%.由此可見(jiàn),低濃度的Cd促進(jìn)多菌靈在土壤中降解,而高濃度的Cd抑制了多菌靈在土壤中的降解.3討論3.1復(fù)合菌群對(duì)土壤微生物的影響多菌靈在土壤中的降解主要是微生物降解,降解產(chǎn)物主要為2-氨基苯并咪唑和鄰苯二胺.多菌靈的降解途徑如圖4所示,首先降解成2-氨基苯并咪唑,然后迅速轉(zhuǎn)化成2-羥基苯并咪唑,此后咪唑環(huán)打開(kāi)進(jìn)一步生成鄰苯二胺,多菌靈的微生物降解過(guò)程屬于礦化作用,其過(guò)程包括水解、羥基化、開(kāi)環(huán)等作用方式.前面研究可知,微生物能加快土壤中的多菌靈的降解,使多菌靈在土壤中的滯留時(shí)間變短,持效性降低.土壤微生物量及其微生物代謝活性的高低直接決定了土壤中殘留農(nóng)藥的多少.朱九生等研究發(fā)現(xiàn)微生物的存在能加快土壤中乙草胺的降解,滅菌土壤中乙草胺的降解半衰期為非滅菌土壤的4~9倍.鄭麗英等也發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)土壤中雙草醚的降解速度有顯著影響,能加快土壤中雙草醚的降解,使土壤中雙草醚的滯留時(shí)間變短,滅菌土壤中雙草醚的降解半衰期為非滅菌土壤中雙草醚降解半衰期的5~7倍.外源添加降解菌可以顯著地加快土壤中多菌靈的降解,實(shí)驗(yàn)施用的復(fù)合菌群能有效地降解土壤中的多菌靈,并且已有報(bào)道指出復(fù)合菌群中的假單胞菌屬Pseudomonassp.和枯草桿菌屬Bacillussubtilis能有效降解土壤中的多菌靈.在假單胞菌Pseudomonassp.的作用下,多菌靈被降解成鄰苯二胺與鄰苯二酚,中間產(chǎn)物主要為2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑.復(fù)合菌群可通過(guò)群落之間的代謝協(xié)同作用迅速降解農(nóng)藥等有機(jī)污染物,相對(duì)于單一菌群,也更易于在污染環(huán)境中成為優(yōu)勢(shì)群體.本實(shí)驗(yàn)表明,高濃度多菌靈(10.0mg·kg-1)的半衰期顯著長(zhǎng)于低濃度多菌靈(5.0mg·kg-1)的半衰期,這可能是由于高濃度的多菌靈抑制了土壤微生物的活性,降低了土壤微生物的數(shù)量,因此土壤中高濃度多菌靈降解比低濃度的要慢.3.2土壤濕度對(duì)微生物的影響根據(jù)前面研究,在一定的土壤濕度范圍內(nèi),隨著濕度提高,多菌靈在土壤中降解速度加快.朱九生等也研究發(fā)現(xiàn),在一定的土壤濕度范圍內(nèi),隨著濕度增高,乙草胺的降解速度加快,在土壤中的半衰期變短.分析原因可能是,合適的土壤濕度有利于土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖,從而促進(jìn)農(nóng)藥的生物降解.同時(shí),在土壤環(huán)境中,土壤濕度可以改變土壤的孔隙度、氧化還原電位、藥物的溶解性以及藥物和土壤的吸附作用等,這些對(duì)農(nóng)藥的降解也可能有一定的影響.多菌靈的微生物降解過(guò)程包括水解、羥基化、開(kāi)環(huán)等作用方式,當(dāng)土壤濕度提高的時(shí)候,溶于水中的多菌靈也隨之增加,水中的OH-等氧化基團(tuán)因光照也隨之增加從而使多菌靈的降解速率加快.3.3cd對(duì)細(xì)菌的影響研究結(jié)果表明,無(wú)論是否加入多菌靈降解菌,低濃度的Cd(5.0mg·kg-1)均加快土壤中多菌靈的降解,而高濃度的Cd(50.0mg·kg-1)減緩?fù)寥乐卸嗑`的降解.有報(bào)道指出,微量Cd2+對(duì)細(xì)菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用,當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度增加到50mg·L-1時(shí),開(kāi)始明顯抑制細(xì)菌的生長(zhǎng).因此,Cd對(duì)多菌靈降解的影響可能與土壤微生物有關(guān),低濃度的Cd促進(jìn)土壤微生物的生長(zhǎng),進(jìn)而加快土壤中多菌靈的降解,而高濃度的Cd抑制土壤微生物的生長(zhǎng),從而導(dǎo)致土壤中多菌靈的降解減緩.另外,Cd對(duì)多菌靈在土壤中吸附解吸的影響,也可能導(dǎo)致土壤中多菌靈降解速度變化.Li等研究發(fā)現(xiàn),在Cd