項(xiàng)目三原料乳入廠驗(yàn)收檢驗(yàn)

任務(wù)一原料乳感官檢驗(yàn)

任務(wù)二原料乳理化指標(biāo)檢驗(yàn)

任務(wù)三原料乳微生物指標(biāo)檢驗(yàn)

任務(wù)三原料乳微生物指標(biāo)檢驗(yàn)

菌落總數(shù)的測(cè)定

(GB

4789.2—2010)

教學(xué)目標(biāo)

1、

了解菌落總數(shù)測(cè)定的意義

2

、學(xué)習(xí)原料乳中菌落總數(shù)測(cè)定方法和原理

3、掌握原料乳菌落總數(shù)測(cè)定檢驗(yàn)程序、操作步驟及結(jié)果報(bào)告教學(xué)內(nèi)容一、原料乳微生物概述二、平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)原料乳菌落總數(shù)

三、菌落總數(shù)其他常用的檢驗(yàn)方法一、原料乳微生物概述(一)乳中微生物的種類(lèi)及貯藏中的變化1、乳中微生物的種類(lèi)(1)產(chǎn)酸菌。指能分解乳糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌

鏈球菌類(lèi)：乳酸鏈球菌、乳酪鏈球菌、糞鏈球菌、嗜熱鏈球菌、液化鏈球菌。

乳酸桿菌類(lèi)：嗜酸乳桿菌、保加亞利乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌。

明串珠菌屬：其次

(2)產(chǎn)氣菌。這類(lèi)微生物能使鮮乳發(fā)酵生成酸和產(chǎn)氣，能使牛乳凝固，產(chǎn)生多孔氣泡，并產(chǎn)生異味和臭味。

大腸菌群，主要有大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，這類(lèi)細(xì)菌除產(chǎn)酸產(chǎn)氣外，還能分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生異味，評(píng)價(jià)乳細(xì)菌污染程度的指標(biāo)之一。

丁酸菌類(lèi)，主要有丁酸梭菌、魏氏梭菌等，使鮮乳產(chǎn)酸產(chǎn)氣，其中的丁酸，氣味惡臭，所產(chǎn)氣體量很大，可使凝固的鮮乳裂成碎塊，形成暴烈發(fā)酵現(xiàn)象。丙酸細(xì)菌，也能使鮮乳產(chǎn)酸產(chǎn)氣，丙酸菌的發(fā)酵可使干酪形成網(wǎng)眼，并產(chǎn)生特殊的芳香風(fēng)味，對(duì)干酪的品質(zhì)有良好的影響。

(3)分解蛋白質(zhì)發(fā)生胨化的細(xì)菌

假單胞菌屬，分解蛋白質(zhì)能力極強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)形成胺和氨，并產(chǎn)生不良?xì)馕丁?/p>

液化糞鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌等使乳產(chǎn)酸與蛋白質(zhì)分解同時(shí)進(jìn)行。

產(chǎn)堿桿菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬等低溫菌，能在低溫條件下使蛋白質(zhì)分解，從而使冷藏乳腐敗變質(zhì)并產(chǎn)生苦味。(4)產(chǎn)堿菌。使鮮乳呈堿性的細(xì)菌主要有糞產(chǎn)堿菌和粘乳產(chǎn)堿菌，糞產(chǎn)堿菌不常存在于腸道內(nèi)，由糞便混入鮮乳中；粘乳產(chǎn)堿菌常存在于水中，故通常由水混入到鮮乳中，使鮮乳變?yōu)檎吵?。這兩種紐重子筆分解檸檬酸鹽為碳酸鹽，而使鮮乳呈堿性反應(yīng)。

(5)使乳變色的細(xì)菌

深藍(lán)色假單胞菌產(chǎn)生的色素，在中性或堿性乳中呈灰色，在酸性乳中呈藍(lán)色。黃假單胞菌在乳中繁殖時(shí)，分解乳中的脂肪、蛋白質(zhì)并產(chǎn)生淡黃色色素，從而使乳呈黃色，此外黃桿菌屬的細(xì)菌增后也可使乳呈黃色。粘質(zhì)沙雷氏菌在乳中純培養(yǎng)可引起紅乳，但通常情況，由于其它細(xì)菌阢下量繁殖抑制了該菌生長(zhǎng)，故紅乳很少見(jiàn)。

(6)脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌群。主要有：熒光極毛桿菌、蛇蛋果假單胞菌、無(wú)色解脂菌、解脂小球菌、干酪乳桿菌、白地霉、黑曲霉、大毛霉等。脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌群。多是使牛乳和乳制品變質(zhì)的細(xì)菌，尤其對(duì)稀奶油和奶油危害更大。一部分脂肪分解菌在干酪生產(chǎn)上為有益菌。

(7)酵母菌和霉菌鮮乳中常見(jiàn)酵母為脆壁酵母、膜脯畢赤氏酵母、漢遜氏酵母和圓酵母屬及假絲酵母屬等。脆壁酵母是生產(chǎn)牛乳酒、酸馬奶酒巴的珍貴菌種。畢赤氏酵母能使低濃度的酒精飲料表面形成干燥皮膜。膜脯畢赤氏酵母主要存在于酸凝乳及發(fā)酵奶油中。圓酵母屬能使乳制品產(chǎn)生酵母味，并能使干酪和煉乳罐頭膨脹。霉菌主要有根霉、毛霉、曲霉、青霉、串珠霉等，大多數(shù)屬于有害菌。與乳品有關(guān)的主要有白地霉、毛霉及根霉屬等，如生產(chǎn)卡門(mén)墻爾干酪、羅奎福特干酪和青紋干酪時(shí)需要依靠霉菌。(8)鮮乳中可能存在的病原菌

常見(jiàn)的有結(jié)核分支桿菌、副結(jié)核分枝桿菌，布氏桿菌、溶血性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)孚L鏈球菌等。

鮮乳的變質(zhì)及其相關(guān)微生物乳制品類(lèi)型變質(zhì)類(lèi)型微生物種類(lèi)鮮乳與市售乳變酸及酸凝固乳球菌、乳桿菌屬、大腸菌群、微球菌屬、微桿菌屬、鏈球菌屬蛋白質(zhì)分解假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、變形桿菌屬、無(wú)色桿菌屬、黃桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、微球菌屬等脂肪分解假單胞菌、無(wú)色桿菌、黃桿菌屬、芽胞桿菌、微球菌屬產(chǎn)氣大腸菌群、梭狀芽胞桿菌、芽胞桿菌、酵母菌、丙酸菌變色類(lèi)藍(lán)假單胞菌（灰藍(lán)致棕色）、類(lèi)黃假單胞菌（黃色）、熒光假單胞菌（棕色）、黏質(zhì)沙雷氏菌（紅色）、紅酵母（紅色）、玫瑰紅微球菌（紅色下沉）、黃色桿菌（變黃）變黏稠黏乳產(chǎn)堿桿菌、腸桿菌、乳酸菌、微球菌等產(chǎn)堿產(chǎn)堿桿菌屬、熒光假單胞菌變味蛋白分解菌產(chǎn)生腐敗味，脂肪分解菌產(chǎn)生酸敗味，球擬酵母（變苦），大腸菌群（糞臭味），變形桿菌（魚(yú)腥臭）2、牛乳在室溫下貯存時(shí)微生物的變化

新鮮牛乳在殺菌前都有一定數(shù)量的、不同種類(lèi)的微生物存在，如果放置在室溫（10-21℃）下，會(huì)因微生物在乳液中活動(dòng)而逐漸使乳液變質(zhì)。室溫下微生物的生長(zhǎng)過(guò)程可分為以下幾個(gè)階段(1)抑制期

(2）乳酸鏈球菌期(3）乳酸桿菌期(4）真菌期(5）胨化菌期

(1)抑制期特征：牛乳中均含有多種抗菌性物質(zhì)，它在最初階段抑制牛乳中的微生物，使其中的微生物反而減少。

(2）乳酸鏈球菌期生鮮牛乳過(guò)了抑菌期后，抗菌物質(zhì)減少或消失，其內(nèi)的微生物迅速繁殖，尤其是細(xì)菌的繁殖占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分解出酸性物質(zhì)，使乳酸度升高，致使牛乳凝塊出現(xiàn)。這些細(xì)菌主要是乳鏈球菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和一些蛋白分解菌等，特別是乳鏈球菌生長(zhǎng)繁殖特別旺盛。乳鏈球菌分解牛乳中的乳糖產(chǎn)生乳酸，牛乳的酸度不斷升高。如大腸菌增殖，將會(huì)有產(chǎn)氣現(xiàn)象出現(xiàn)。由于牛乳酸度不斷升高，其他腐敗細(xì)菌的活動(dòng)就受抑制。當(dāng)酸度升高至一定限度時(shí)（pH4.5)，乳鏈球菌本身受到抑制不再繼續(xù)繁殖，相反會(huì)逐漸減少，特征：這時(shí)就有牛乳凝塊出現(xiàn)，有時(shí)有氣體產(chǎn)生。

(3）乳酸桿菌期乳酸鏈球菌在牛乳中繁殖，使牛乳PH下降至6左右．這時(shí)乳酸桿菌的活動(dòng)力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)PH繼續(xù)下降至4.5以下時(shí)，由于乳酸桿菌耐酸力較強(qiáng)，尚能繼續(xù)繁殖并產(chǎn)酸。此時(shí)還有非常耐酸的丙酸菌、孢子形成菌等出現(xiàn)，它們會(huì)消耗部分乳酸而形成一些優(yōu)勢(shì)菌。特征：乳液中可出現(xiàn)大量乳凝塊，并有大量乳清析出。

(4）真菌期

當(dāng)酸度繼續(xù)下降至PH3.5—3時(shí)，絕大多數(shù)微生物被抑制甚至死亡，僅酵母和霉菌尚能適應(yīng)高酸性的環(huán)境，并能利用乳酸及其他一些有機(jī)酸，于是形成優(yōu)勢(shì)菌。特征：由于酸的被利用，乳液的酸度會(huì)逐漸降低，使乳液的PH不斷上升接近中性。

(5）胨化菌期

經(jīng)過(guò)上述幾個(gè)階段的微生物活動(dòng)后，乳液中的乳糖大量被消耗，殘余量已很少，在乳中僅是蛋白質(zhì)和脂肪尚有較多的量存在。因此，適宜于分解蛋白質(zhì)和脂肪的細(xì)菌在其中生長(zhǎng)繁殖。這樣就產(chǎn)生了乳凝塊被消化（液化）、乳液的pH逐步提高向堿性方向轉(zhuǎn)化，并有腐敗的臭味產(chǎn)生的現(xiàn)象。這時(shí)的腐敗菌大部分是屬于芽胞桿菌屬、假單胞菌屬以及變形桿菌屬的一些細(xì)菌。特征：乳凝塊被消化（液化）、乳液的pH逐步提高向堿性方向轉(zhuǎn)化，并有腐敗的臭味產(chǎn)生的現(xiàn)象。

(二)菌落總數(shù)定義及檢驗(yàn)意義

乳中細(xì)菌數(shù)量的表示方法主要有兩種：

1、菌落總數(shù)

2、細(xì)菌總數(shù)二、平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)原料乳菌落總數(shù)一、原理

1、菌落總數(shù)

是指一定數(shù)量和面積的食品檢樣，在一定條件下(如樣品的處理、培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)時(shí)間、溫度等)進(jìn)行培養(yǎng)，使適應(yīng)該條件的每一個(gè)活菌必須而且只能形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)所得到的菌落總數(shù)量。通常以1g或1mL或1cm2樣品中所含的菌落數(shù)量cfu(菌落形成單位)來(lái)表示。一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、是否需要氧氣等。

目前中國(guó)的食品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定細(xì)菌總數(shù)實(shí)際上是指菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)：并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類(lèi)，只包括一群在計(jì)數(shù)平板瓊脂中生長(zhǎng)發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以有時(shí)被稱(chēng)為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。食品中細(xì)菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質(zhì)量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗(yàn)，才能對(duì)食品做出較全面的評(píng)價(jià)。

2、細(xì)菌總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食品檢樣，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚砗螅陲@微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱(chēng)細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1

g或1

mL樣品中的細(xì)菌總數(shù)來(lái)表示。二

、

材料

1、

食品檢樣

2、

培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液

3、

其它

無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌吸管，電爐、恒溫培養(yǎng)箱等。

四、

流程

1、檢樣2、做幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液3、選擇2~3個(gè)適宜稀釋度各1

mL,分別加入滅菌平皿內(nèi)4、平皿內(nèi)傾注15～20

mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻

5、36±1℃培養(yǎng)48±2小時(shí)或（24±2）小時(shí)6、記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的各平板菌落數(shù)量7、計(jì)算菌落總數(shù)→報(bào)告五、

步驟

(一)

取樣、稀釋和培養(yǎng)

1、

以無(wú)菌操作取檢樣25g（mL），放于225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振蕩或研磨制成1:10的均勻稀釋液。固體和半固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000～10000r/min的速度處理1～2min，制成1:10的均勻稀釋液。

2、用1

mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1

mL，沿管壁徐徐注入含有9

mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內(nèi)，振搖試管或反復(fù)吹打混合均勻，制成1:100的稀釋液。

3

、另取1

mL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1

mL吸管。

4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)分別取1ml稀釋液（不含樣品）加入兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。

5

、稀釋液移入平皿后，將冷卻至46℃瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15～20ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。

6、

待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，水產(chǎn)品30±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)72±3h。如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4毫升），凝固后培養(yǎng)。

（二）

菌落記錄方法

做平板菌落數(shù)記錄時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0～4℃，但不要超過(guò)24h。

1、

平皿菌落數(shù)的選擇

選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。每一個(gè)稀釋度應(yīng)采用兩個(gè)平皿，大于300的可記為多不可計(jì)。

2、其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，以代表一個(gè)平板的菌落數(shù)。

3、當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來(lái)源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開(kāi)計(jì)數(shù)。

（三）菌落總數(shù)的計(jì)算

1、若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。試樣例次稀釋度選定計(jì)數(shù)稀釋度菌量/(個(gè)/g或mL)10-210-310-41平均菌落數(shù)380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0x10452612510-22.6x1036無(wú)法計(jì)數(shù)56831210-43.1x106

2、若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按如下公式計(jì)算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)

式中：

N―樣品中菌落數(shù)；

∑C―平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

nl―第一個(gè)適宜稀釋度平板數(shù)；

n2―第二個(gè)適宜稀釋度平板數(shù)；

d―稀釋因子（第一稀釋度）。例如：

稀釋度

1:100（第一稀釋度）

1:1000（第二稀釋度）

菌落數(shù)

232，244

33，35

232+244+33+35(2+0.1×2)×10-2

=