第七講手性藥物的HPLC分析方法

一、概述

分子中含有手性中心的藥物為手性藥物.20世紀(jì)90年代以來(lái),藥物的光學(xué)活性與生物活性之間的關(guān)系引起人們?nèi)找嬷匾?手性藥物的研究與開(kāi)發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥工作者的一個(gè)重要研究方向.手性藥物的研究近二十年來(lái)發(fā)展速度較快.2001年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予3位從事不對(duì)稱(chēng)反應(yīng)研究的科學(xué)家.一、概述近年來(lái)以單一對(duì)映體上市的藥物比例在增加.

1999年單一對(duì)映體藥物制劑1150億美元占世界藥品市場(chǎng)總額32%;

2001年單一對(duì)映體藥物制劑1393億美元

占世界藥品市場(chǎng)總額36%;預(yù)計(jì)10年后突破額達(dá)2000億美元目前利用手性的原理與技術(shù)開(kāi)發(fā)新藥，已成為國(guó)際醫(yī)藥界的新方向之一.

一、概述

手性藥物在我國(guó)的市場(chǎng)潛力也很大.中國(guó)目前的藥物市場(chǎng)居全球第7位,居美國(guó)、日本、德國(guó)、法國(guó)、英國(guó)和意大利之后,到2010年,中國(guó)的藥物市場(chǎng)將超越英國(guó)和意大利列第5位.隨著人們對(duì)用藥安全、高效等方面要求,手性藥物的需求會(huì)逐年增長(zhǎng).

一、概述1992年,美國(guó)FDA發(fā)布手性藥物指導(dǎo)原則,要求所有在美國(guó)申請(qǐng)上市的消旋體新藥,均需測(cè)定其立體異構(gòu)體組成,并提供報(bào)告說(shuō)明藥物中所含對(duì)映體各自的藥理作用、毒性及臨床效果.加拿大、歐共體等也制訂了相關(guān)的“指南”.一、概述

2006年1月,我國(guó)藥審中心制定《手性藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（第二稿）》一、概述

臨床應(yīng)用的手性藥物,除天然和半合成藥物外,人工合成藥物仍以外消旋體供藥為主,約占全部合成手性藥物的87%以上.一、概述

盡管手性藥物的不同對(duì)映體之間在理化性質(zhì)方面有許多相似的地方,藥物在參與體內(nèi)生理過(guò)程時(shí)涉及到手性分子或手性環(huán)境,則不同的立體異構(gòu)體產(chǎn)生不同的治療效果、副作用甚至毒性反應(yīng).

一、概述

(1)藥物的藥理作用兩個(gè)對(duì)映體中主要由其中的一個(gè)對(duì)映體產(chǎn)生

不同構(gòu)型的立體異構(gòu)體的藥理作用也可能不同,大致可分為以下幾種情況:

如S-萘普生的鎮(zhèn)痛作用比其R異構(gòu)體強(qiáng)35倍.特布他林的R-對(duì)映體的支氣管擴(kuò)張作用比其S異構(gòu)體強(qiáng)200倍.一、概述

(2)兩個(gè)對(duì)映體具有完全相反的藥理作用

如新型苯哌啶類(lèi)鎮(zhèn)痛藥-哌西那朵的右旋異構(gòu)體為阿片受體的激動(dòng)劑,而其左旋體則為阿片受體的拮抗劑.

右丙氧芬是鎮(zhèn)痛藥；左丙氧芬是鎮(zhèn)咳藥一、概述(3)一個(gè)有活性；另一個(gè)對(duì)映體有嚴(yán)重毒副作用

鎮(zhèn)靜藥反應(yīng)停（thalidomide,沙利度胺）右旋體（R型）有鎮(zhèn)靜作用,左旋體（S型)具有胚胎毒性和致畸作用.17000例以上一、概述(4)兩對(duì)映體藥理作用不同,但合并用藥有利

如降壓藥-萘必洛爾的右旋體為β-受體阻滯劑,而左旋體能降低外周血管的阻力,并對(duì)心臟有保護(hù)作用；

一、概述抗高血壓藥物茚達(dá)立酮的R異構(gòu)體具有利尿作用,但有增加血中尿酸的副作用,而S異構(gòu)體卻有促進(jìn)尿酸排泄的作用,可有效降低R異構(gòu)體的副作用,兩者合用有利.S與R異構(gòu)體的比例為1:4或1:8時(shí)治療效果最好.(5)兩個(gè)對(duì)映體具有完全相同的藥理作用

如普羅帕酮的兩個(gè)對(duì)映體具有相同的抗心率失常作用.

無(wú)需使用單一對(duì)映體.一、概述

消旋體藥物？單一対映體藥物？固定比例（非消旋體）對(duì)映體？

一、概述對(duì)手性藥物開(kāi)發(fā)兩種對(duì)映體藥理性質(zhì)和治療作用類(lèi)似或互補(bǔ)；對(duì)映體在體內(nèi)有明顯的外消旋作用或不穩(wěn)定；缺少對(duì)映體選擇性合成途徑；無(wú)治療作用的對(duì)映體無(wú)毒性或毒性可忽略.哌甲酯——治療兒童多動(dòng)癥.治療作用只存在

d-對(duì)映體,l-對(duì)映體不產(chǎn)生有害的毒副作用,生產(chǎn)成本較低.消旋體藥物一、概述

消旋體藥物中的藥理活性和治療作用只由單一對(duì)映體產(chǎn)生.消除（或減輕）原有混旋體藥物的副作用；降低使用劑量；提高療效；故使用單一活性異構(gòu)體代替外消旋體藥物,已成為當(dāng)今制藥業(yè)的趨勢(shì).

2003年世界銷(xiāo)售額領(lǐng)先前10之一：降血脂藥辛伐他丁、胃酸分泌抑制劑艾美拉唑單一異構(gòu)體藥物一、概述固定比例（非消旋體）對(duì)映體藥物

為產(chǎn)生最佳療效需要開(kāi)發(fā)兩種對(duì)映體固定比例的非消旋混合物.茚達(dá)立酮是以消旋體形式上市的抗高血壓藥.右旋體利尿作用,但引起尿酸滯留,左旋體排尿酸作用,因此確定兩者比例消除不良反應(yīng),達(dá)最佳療效.現(xiàn)正研究1：4或1：8混合物.一、概述二、手性藥物的合成純度控制

手性藥物藥學(xué)研究的主要任務(wù)就是為藥物的篩選與進(jìn)一步研究提供足夠數(shù)量與純度的立體異構(gòu)體.

在原料藥制備工藝研究時(shí)應(yīng)根據(jù)手性中心的引入方式,采取有效的過(guò)程控制手段,嚴(yán)格控制產(chǎn)品的光學(xué)純度.二、手性藥物的合成純度控制

光學(xué)純度(Opticalpurity)：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的旋光度,在兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體混合物中,一個(gè)對(duì)映體所占的百分?jǐn)?shù).

1.直接從起始原料或試劑中引入

（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

光學(xué)純度主要取決于以下兩個(gè)方面：（1）起始原料或試劑的光學(xué)純度；（2）后續(xù)反應(yīng)過(guò)程是否會(huì)影響到已有的手性中心,從而產(chǎn)生外消旋化的可能性及程度.

首先要采用立體專(zhuān)屬性的分析方法嚴(yán)格控制起始原料或試劑的光學(xué)純度,制定合理可行的手性雜質(zhì)的限度.

（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

1.直接從起始原料或試劑中引入

其次要根據(jù)后續(xù)反應(yīng)的機(jī)理,充分分析后續(xù)反應(yīng)是否會(huì)影響已有手性中心的構(gòu)型,如可能會(huì)產(chǎn)生影響時(shí),應(yīng)研究與優(yōu)化工藝條件,盡量避免或減少外消旋化的產(chǎn)生.

（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

1.直接從起始原料或試劑中引入

最后在進(jìn)行工藝研究時(shí),對(duì)引入手性中心后的每步反應(yīng)的中間體中的立體異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),分析與監(jiān)測(cè)外消旋化的可能性.（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

1.直接從起始原料或試劑中引入

采用立體選擇性或?qū)傩缘姆磻?yīng)（包括酶催化反應(yīng)）在分子中引入所需構(gòu)型的手性中心,所以終產(chǎn)品的光學(xué)純度直接取決于該步反應(yīng)的立體選擇性.

（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

2.通過(guò)不對(duì)稱(chēng)合成

采用手性拆分試劑與外消旋的中間體或終產(chǎn)品反應(yīng)生成非對(duì)映異構(gòu)體,分離純化得到所需的非對(duì)映異構(gòu)體,再去掉手性拆分試劑,從而得到所需的手性藥物.（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

3.消旋體的拆分

控制終產(chǎn)品的光學(xué)純度,采取以下措施：

首先應(yīng)采用光學(xué)純度盡可能高的拆分試劑；

3.消旋體的拆分

除此之外,采用制備型的手性色譜法來(lái)直接分離對(duì)映異構(gòu)體,從而得到所需的目標(biāo)化合物.

其次,應(yīng)盡量純化與拆分試劑反應(yīng)所得的非對(duì)映異構(gòu)體；

（一）合成過(guò)程中控制光學(xué)純度二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

手性藥物處方篩選及工藝研究的重點(diǎn)是通過(guò)選擇適宜的輔料和工藝條件,避免引起手性藥物立體構(gòu)型的轉(zhuǎn)變.

（二）選擇制劑的劑型、處方與工藝二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

例如,研究顯示手性藥物在溶液狀態(tài)下立體構(gòu)型不夠穩(wěn)定,可發(fā)生外消旋化,則不宜選擇注射劑、口服溶液等液體劑型.

二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

（二）選擇制劑的劑型、處方與工藝

選擇手性藥物制劑的劑型時(shí)需要考慮的重要因素是穩(wěn)定的pH范圍,固態(tài)及液態(tài)下構(gòu)型穩(wěn)定情況,對(duì)光、熱、空氣等因素的穩(wěn)定情況等.

手性藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的特點(diǎn)是質(zhì)量控制項(xiàng)目要體現(xiàn)其光學(xué)特征的質(zhì)量控制.三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

（一）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1.研究項(xiàng)目的確定

①比旋度

②立體專(zhuān)屬性的鑒別項(xiàng)

③立體異構(gòu)體雜質(zhì)檢查

④立體專(zhuān)屬性的含量測(cè)定等是反映藥物立體化學(xué)特征的檢測(cè)項(xiàng)目.

如果鑒別和檢查項(xiàng)能夠反映其光學(xué)特征和光學(xué)純度時(shí),含量測(cè)定可采用非立體專(zhuān)屬性的測(cè)定方法.三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)限量規(guī)定：對(duì)映體無(wú)反作用或僅有輕微毒性時(shí)：對(duì)映體過(guò)量≥98％對(duì)映體有嚴(yán)重副作用時(shí)：對(duì)映體過(guò)量≥99.5％對(duì)映體無(wú)活性,但副作用也較輕微時(shí)：對(duì)映體過(guò)量≥99％三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)穩(wěn)定性研究中手性雜質(zhì)的變化情況,判斷手性藥物的立體構(gòu)型在各種環(huán)境因素的影響下,以及放置過(guò)程中是否穩(wěn)定,是否有外消旋化現(xiàn)象的產(chǎn)生,從而確定是否需在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制這些手性雜質(zhì).二、手性藥物藥學(xué)研究的基本思路

穩(wěn)定性研究（一）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究首先應(yīng)建立靈敏、立體專(zhuān)屬性的光學(xué)純度檢測(cè)指標(biāo),以監(jiān)測(cè)立體構(gòu)型的穩(wěn)定性.

穩(wěn)定性研究三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

穩(wěn)定性研究中采用的手性分析方法,要進(jìn)行全面的驗(yàn)證工作,以保證分析方法的立體專(zhuān)屬性.

穩(wěn)定性研究三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

高效液相色譜法毛細(xì)管電泳法氣相色譜法薄層色譜法超臨界流體色譜法比旋度法三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.分析方法及其選擇

對(duì)于光學(xué)純度檢查方法的驗(yàn)證,立體專(zhuān)屬性是考察的重點(diǎn).立體專(zhuān)屬性系指在其它手性雜質(zhì)可能共存的情況下,采用的方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的特性.

三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.分析方法專(zhuān)屬性的驗(yàn)證方法專(zhuān)屬性的驗(yàn)證,可采用消旋體或與對(duì)映異構(gòu)體混和進(jìn)樣的方式考察對(duì)映體間的分離度.三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.分析方法專(zhuān)屬性的驗(yàn)證三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.1原料藥

【性狀】項(xiàng)下的比旋度是手性藥物的特征之一,可以說(shuō)明藥品的光學(xué)特征和純度.

【檢查】項(xiàng)下光學(xué)異構(gòu)體的檢查是手性藥物重要的質(zhì)控項(xiàng)目之一.

三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【含量測(cè)定】在鑒別和檢查項(xiàng)能夠反映手性藥物光學(xué)特征和光學(xué)純度時(shí),可采用非立體專(zhuān)屬性的測(cè)定方法.

三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.柱前手性衍生-對(duì)映體與手性試劑反應(yīng)

四、手性藥物的HPLC分析方法3.手性固定相拆分

2.手性流動(dòng)相拆分-手性試劑加入流動(dòng)相中

直接法手性流動(dòng)相添加劑法（CMPA）手性固定相法（CSP）

引入“手性識(shí)別試劑”或“手性環(huán)境”（手性固定相、手性流動(dòng)相添加劑）至色譜系統(tǒng)中.四、手性藥物的HPLC分析方法

間接法：又稱(chēng)手性試劑衍生化（CDR）

四、手性藥物的HPLC分析方法對(duì)映體混合物以手性試劑作柱前衍生,形成一非対映異構(gòu)體對(duì),使藥物對(duì)映體間呈現(xiàn)理化特性的差異,然后以常規(guī)固定相分離

測(cè)定.

均以現(xiàn)代HPLC技術(shù)為基礎(chǔ),并引入不對(duì)稱(chēng)中心,不同的是間接法（手性衍生法）是將其引入分子（溶質(zhì)）內(nèi)，而直接法（手性流動(dòng)相添加劑法、手性固定相法）引入分子間.四、手性藥物的HPLC分析方法直接法和間接法共同特點(diǎn)引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特性的差異是手性HPLC進(jìn)行光學(xué)異構(gòu)體拆分的基礎(chǔ).色譜柱：Chiral-AGP(100mm×4.0mm)流動(dòng)相：含0.5％異丙醇的20mM醋酸銨緩沖溶液（pH4.1，醋酸鹽總濃度約110mM）流速：1mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm四、手性藥物的HPLC分析方法手性固定相法

牛血清白蛋白固定相（BSA）可用于酸性化合物對(duì)