分光光度技術(shù)概念分光光度法(Spectrophotography),又稱為比色法，它是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)。有色溶液對光線有選擇性的吸收作用，不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長的光的吸收能力不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。比色法只限于可見光區(qū)，分光光度法可擴展到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。使用的光譜范圍200—1000nm紫外光區(qū)：200—400nm可見光區(qū)：400—760nm紅外光區(qū)：760—1000nm基本原理物質(zhì)的吸收光譜與它們的本身的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長光線的吸收能力也不同。每種物質(zhì)都具有特定的吸收光譜，在一定條件下，其吸收程度與該物質(zhì)濃度成正比，因此可利用各種物質(zhì)不同的吸收光譜及其強度，對不同物質(zhì)進行定性和定量分析。分光光度法根據(jù)的原理是Lambert—Beer定律，該定律闡明了溶液對單色光吸收程度與溶液濃度及溶液厚度之間的關(guān)系。出射光I入射光I。。溶液派度L出射光I入射光I。。溶液派度L盛溶液的容器的厚度朗伯(Lambert)定律：當單色光通過一吸收光的介質(zhì)時，其光強度隨吸收光介質(zhì)的厚度增加而成指數(shù)減少，即I/I0=e*L/。：入射光強度， /：出射光強度，乙介質(zhì)的厚度e:自然對數(shù)的底，即2.718 K1:溶液的吸光率ln(I0/I)=K1l換算成常用對數(shù)式，即log(Io/I)=0.4343-K1l令K=0.4343-K1貝0log(I0/I)=Kl此處以K為吸光率也就是說：在溶液濃度不變時，溶液對光的吸收隨溶液厚度的增大而增大。比爾(Beer)定律：單色光通過一光吸收介質(zhì)時，光強度隨介質(zhì)濃度增長而成指數(shù)減少，即I/Io=e*LC:溶液濃度log(Io/I)=KC也就是說：溶液厚度不變時，溶液對光的吸收隨溶液濃度的增大而增大。Lambert—Beer定律如果同時考慮吸收溶液的濃度和厚度對光吸收的影響，將以上兩式結(jié)合，則得出log(I0/I)=KCl令T=(I/I0)A=log(I0/I)則A=KClA為吸光度，T為透光度K(L-mol-1-cm-1)是一常數(shù)，即削光系數(shù)，也叫摩爾吸光度；計算標準管法(標準比較法)用一已知濃度的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，在根據(jù)公式計算。A=KCL A=KCL,1 111 2 222A1:已知濃度標準管 A2:未知濃度測定管A1/A2=(K1C1L1)/(K2C2L2)因為使用的比色杯徑長相同，即L]=l2，所以上式可改寫為：A1/A2=(K1C1)/(K2C2)又因為標準液和測定液中的溶質(zhì)為同一物質(zhì)，所以K值相同，即：K1=K2所以上式可改寫為A1/A2=C1/C2所以C2=(A2/A1)C1實驗中，由于比色皿本身和溶劑也會產(chǎn)生一定的光吸收，所以設(shè)置一個空白管，即其中除了待測溶質(zhì)以外，其他的成分完全相同。以空白管對準光路對儀器調(diào)零，消除非待測物的吸收，所測值即為待測物的光吸收。標準曲線法制備一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度三.儀器的結(jié)構(gòu)定義：對某一波長的光吸收值（吸光度）進行測定的儀器稱為分光光度計。分類：根據(jù)所測光譜范圍分為：紫外、可見、紅外分光光度計及萬用（全波段）分光光度計。結(jié)構(gòu)組成光源：要求能提供所需波長范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強度。常用光源有：鎢燈或鹵鎢燈：工作范圍360—1000nm，用于可見光區(qū)，近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)氫燈或氘燈：工作范圍150—400nm，可作紫外光分光光度計的光源分光系統(tǒng)（單色器）：把混合光分解為單一波長光的裝置，多用棱鏡或光柵作為色散元件，將不同波長的光分開吸收池（比色皿、比色池）：用來盛待測溶液。一般用玻璃、石英制成。小于330nm的光不能用玻璃比色皿，所以紫外吸收時要用石英比色皿。檢測器：光電池、光電管、光電倍增管組成測量裝置：以電流表、波長分度盤和測量讀數(shù)盤的形式輸出測量結(jié)果，現(xiàn)代的儀器長附有自動記錄器，可自動描出記錄曲線。蛋白質(zhì)化學(xué)實驗雙縮脲測定蛋白含量原理：蛋白分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似，在堿性溶液中與Cu2+結(jié)合形成紫色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，紫色化合物在520nm波長下有最大光吸收。在一定濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，所以可用比色法測定蛋白質(zhì)含量。含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)才有此反應(yīng)，故氨基酸無此反應(yīng)。方法：采用標準曲線法標準曲線制作（1）取小試管6支，編號，按下表操作雙縮脲法操作步驟表試劑（mL）管號123456標準蛋白質(zhì)溶液0.10.30.50.70.9—生理鹽水0.90.70.50.30.11.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0（2）混勻后，于37°C水浴中保溫15min,在520nm波長下比色，以第6管調(diào)零點，測得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度的克數(shù)為橫坐標，繪成曲線。樣品測定取蛋白質(zhì)樣品0.1mL，加生理鹽水0.9mL，再加雙縮脲試劑4mL，于37C水浴中保溫15min，在520nm波長下比色，測得其吸光度，根據(jù)吸光度值查標準曲線即得出每100mL樣品中蛋白質(zhì)的克數(shù)?？捡R斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量原理：考馬斯亮蘭G250存在著兩種不同的顏色，紅色和藍色。它與蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色變成藍色，最大吸收峰從465nm變成595nm，通過測定595nm處的光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。此結(jié)合物1小時內(nèi)穩(wěn)定。優(yōu)點：靈敏度高，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達川g；測定速度快、簡便，只需一種試劑；干擾物質(zhì)少。方法：采用標準管法取試管3支，編號，按下表操作考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)表試劑（mL）空白管標準管標本管生理鹽水標準蛋白溶液0.10.1樣品0.1考馬斯亮蘭試劑5.05.05.0②混勻，室溫放置5min，在波長595nm處，以空白管調(diào)零點。測定各管的吸光度值。計算（OD標本/OD標準）X50=樣品中蛋白質(zhì)的含量pg/mL紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量1.原理：蛋白質(zhì)分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波長范圍內(nèi)吸收峰的吸光度值與其濃度成正比，可作定量測定。由于各種蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸含量的不同，因而此法適于測定與所采用的標準蛋白質(zhì)的氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)，以減少誤差。一般核酸在280nm波長處也有吸收，對蛋白質(zhì)測定有干擾作用，但核酸的吸收高峰在260nm，因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD260和OK。，通過計算消除核酸對蛋白質(zhì)的影響算出蛋白質(zhì)的含量。因為蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。方法：采用標準曲線法標準蛋白質(zhì)溶液：任選一種蛋白質(zhì)溶液，經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量，用生理鹽水稀釋至濃度為1mg/mL。取試管6支，編號，按下表操作。紫外吸收法標準曲線制作步驟表試劑（mL） 管號123456標準蛋白質(zhì)溶液0.51.01.52.02.50生理鹽水3.53.02.52.01.54.0混勻