酮康唑?qū)Υ笫蟾挝⒘ｓw細(xì)胞色素p450同工酶a31活性的影響

細(xì)胞色素p450（cyp450）是含有feli函數(shù)的酶蛋白，也被稱為混合功能氧化酶或單加氧酶。這是肝臟中藥物代謝i的主要酶。cyp4503a4（cyp3a4）是一個(gè)重要的藥物代謝酶。大約38個(gè)類別中有150多種藥物代謝，約占所有藥物的50%。對于各種腫瘤藥物的代謝，如環(huán)磷酰胺、紫杉醇、長春新堿和基于苦挑選的磺酸鹽，這些藥物通過cyp3a4代謝，大鼠中相應(yīng)的亞型為cyp3a。睪酮是CYP3A4體外活性研究的首選探針底物,同時(shí),酮康唑是作為CYP3A4體外抑制劑的專屬工具藥,是檢測藥物抑制作用的陽性對照。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上,在體外孵育體系中運(yùn)用HPLC法以睪酮作為大鼠CYP3A1的探針底物,定量檢測CYP3A1的特異性代謝底物6-β-羥基睪酮,觀察酮康唑?qū)Υ笫蟾挝⒘ｓwCYP3A1活性的影響,建立一種用大鼠肝微粒體快速考察藥物體外CYP3A1抑制作用的方法。1材料和機(jī)器1.1dpe現(xiàn)實(shí)dpeWaters高效液相系統(tǒng):Waters717plusAutosample,Waters2487DualλAbsorbanceDetector,Waters1525BinaryHPLCPump。1.2大松、酮康唑二核苷酸磷酸酯類睪酮(testosterone,TS,TRC公司,純度≥98%);6-β-羥基睪酮(6-β-OHT,TRC公司,純度≥98%);氫化可的松(hydrocortisone,Hy,Sigma公司,純度≥99%);酮康唑(ketoconazole,Sigma公司,純度≥99%);煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH,Sigma,美國);甲醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、二氯化鎂等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SD大鼠6只,雄性,SPF級(jí),體重(215±10)g,雄性,中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證為0092212。2方法和結(jié)果2.1藥房與動(dòng)態(tài)研究2.1.1柱溫度和流動(dòng)相色譜柱:大連依力特HypersilBDSC18柱(4.6mm×150mm,5μm);柱溫:室溫;流動(dòng)相:甲醇-10mmol/LNa2HPO4水溶液(pH8.25)(體積比50∶50);檢測波長:254nm;流速:1ml/min;進(jìn)樣量20μl,內(nèi)標(biāo)為氫化可的松。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及實(shí)驗(yàn)用松溶液的配制精密稱取0.288g睪酮至5ml容量瓶中,加甲醇溶解稀釋至刻度,搖勻,得到0.2mol/L的TS母液。置冰箱4℃?zhèn)溆?。精密稱取1mg6-β-羥基睪酮至5ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,得200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置冰箱4℃中備用。精密稱取氫化可的松25mg至5ml容量瓶中,用甲醇:水(1∶1)溶解稀釋到刻度,搖勻,即得到5g/L的儲(chǔ)備液,置冰箱4℃?zhèn)溆?。精密稱取酮康唑2.5mg至5ml量瓶中,用甲醇:水(1∶1)溶解稀釋到刻度,搖勻,即得到500mg/L的儲(chǔ)備液,置冰箱4℃?zhèn)溆谩?.1.3肝組織勻漿的制備大鼠禁食12h,自由飲水,各大鼠稱重后,將動(dòng)物斷頭處死,剖腹,取出肝臟;用4℃生理鹽水沖洗2～3次,直至洗出液為無色或淡黃色;吸干組織并稱重,取5g左右肝組織;在0.25mol/L蔗糖溶液中制成20%W/V的勻漿,組織勻漿液在10000g離心20min,保留上清液,棄去下層沉淀物;取上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管,在105000g離心60min,棄去上清液,沉淀用0.1mol/LTris-HCL緩沖液重懸;再105000g離心60min,沉淀用10mlTris-HCL緩沖液混懸均勻,分裝,于-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取標(biāo)準(zhǔn)蛋白(5mg/ml)10μl,用PBS溶液稀釋至0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0,1,4,8,12,16,20μl加到96孔板中,用磷酸緩沖液(pH7.4)(PBS)稀釋至20μl,配置BCA工作液,在樣品孔中加入配置好的BCA工作液200μl,于37℃恒溫箱中靜置30min,于562nm測定吸收度,以蛋白濃度與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測得大鼠肝微粒體濃度。2.1.5氫化鈉系投資主體3.4的水浴加熱反應(yīng)精密吸取0.02mol/L的睪酮溶液5μl于10ml玻璃離心管中,加入適量制備好的空白肝微粒體,使藥物反應(yīng)體系中肝微粒體蛋白終濃度為0.25mg/ml,用磷酸緩沖液(pH7.4)補(bǔ)足體系至480μl。于37℃水浴中預(yù)孵育5min后,加入20μlNADPH(0.01mol/L)啟動(dòng)反應(yīng),37℃水浴20min后,加入10μl內(nèi)標(biāo)氫化可的松(50mg/L),加入3.5ml冰冷乙酸乙酯終止反應(yīng)。取終止代謝的樣品,渦旋1min,室溫放置10min,3500r/min離心10min,吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中,于真空干燥箱中揮干后用甲醇:水(1∶1)400μl溶樣。渦旋1min,13000r/min離心15min。吸取上清250μl進(jìn)樣。2.1.6峰分離穩(wěn)定性分析上述試驗(yàn)條件下,測得6β-OHT,內(nèi)標(biāo)氫化可的松,TS與其他雜質(zhì)組分峰分離良好,保留時(shí)間分別約為5.740,8.303,26.962min。3種物質(zhì)與TS的其他代謝產(chǎn)物分離良好,且空白肝微粒體中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。2.1.7樣品處理和線性范圍取10ml具塞離心管,分別加入0.3125,0.625,1.25,2.5,5,10,20mg/L的6β-OHT溶液50μl,于各管中加入5μl0.2mol/L的TS溶液,以及滅活大鼠肝微粒體(終濃度0.25mg/ml),用PBS補(bǔ)足體系至500μl,按照上述樣品處理的方法操作,以6β-OHT與內(nèi)標(biāo)氫化可的松的面積比為橫坐標(biāo),其各自對應(yīng)的6β-OHT的濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=19.175X-1.277(R2=0.9997),6β-OHT的線性范圍為0.3125～20mg/L,最低定量限為0.3125mg/L,這一范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.1.8方法的精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性取大鼠滅活肝微粒體(終濃度0.25mg/ml),加入5μl0.2mol/L的TS溶液,分別加入0.625,2.5,10μg/ml6β-OHT溶液50μl,用PBS補(bǔ)充體系至500μl,按照上述樣品處理的方法操作,進(jìn)樣測定,于當(dāng)天不同時(shí)間內(nèi)測定峰面積各5次,連續(xù)3d,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度,結(jié)果見表1。2.1.9樣品處理和進(jìn)樣測定取大鼠滅活肝微粒體(終濃度0.25mg/ml),加入5μl0.2mol/L的TS溶液,分別加入0.625,2.5,10mg/L6β-OHT溶液50μl,用PBS補(bǔ)充體系至500μl,按照上述樣品處理的方法操作,進(jìn)樣測定。每個(gè)濃度水平測定5次,測定峰面積比,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算6β-OHT檢測量,以檢測量與加入量之比計(jì)算6β-OHT的方法回收率。取滅活肝微粒體(終濃度0.25mg/ml),加入5μl0.2mol/l的TS溶液,分別加入0.625,2.5,10μg/ml6β-OHT溶液50μl,用磷酸緩沖液(pH7.4)補(bǔ)充體系至500μl,按照上述樣品處理操作,進(jìn)樣測定。每個(gè)濃度水平測定5次;另取上述3個(gè)濃度的6β-OHT溶液50μl,加甲醇:水(1∶1)至400μl,渦旋1min,13000r/min離心15min,吸取上清250μl,進(jìn)樣測定。每個(gè)濃度測定5次,將2組峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值之比進(jìn)行比較,計(jì)算6β-OHT的萃取回收率,結(jié)果見表1。2.2cyp31a活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.2.1體外添加nadph法分成對照組及藥物處理組共7組,每組3個(gè)樣本。首先把肝微粒體加入到21個(gè)離心管中(終濃度為0.25mg/ml);然后各處理組分別加入5、10、20、50、100、200mg/L的酮康唑各25μl,再加入含有PBS培養(yǎng)液;對照組只加入上述培養(yǎng)液;混勻后放入37℃培養(yǎng)箱中孵育15min,然后在7個(gè)組加入0.2mol/L的睪酮5μl、0.01mol/LNADPH20μl和0.25mmol/L二氯化鎂10μl,使孵育體系體積為500μl,繼續(xù)孵育20min,最后加入內(nèi)標(biāo)物氫化可的松10μl,并用乙酸乙酯3.5ml終止反應(yīng)。取終止代謝的樣品渦旋1min后室溫放置10min,3500r/min高速冷凍離心機(jī)離心10min,吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管,然后在真空干燥箱中吹干,用甲醇:水(50∶50)400μl溶解,渦旋1min后再轉(zhuǎn)移到另外的離心管中用13000r/min離心15min,吸取上清液250μl用高效液相色譜儀測定睪酮經(jīng)3A1代謝所生成6-β羥基睪酮的量,用HPLC法測定的AUC表示酶的活性,以對照組酶活性為100%,計(jì)算CYP酶的同工酶3A1酶相對活性。2.2.2統(tǒng)計(jì)處理用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。數(shù)據(jù)用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),組間率比較用χ2檢驗(yàn)。3cyp450的藥物安全性評價(jià)本實(shí)驗(yàn)觀察酮康唑?qū)Υ笫蟾挝⒘ｓwCYP450代謝睪酮的影響,結(jié)果表明,隨著酮康唑濃度的不斷升高,CYP3A1活性隨之逐漸下降,表明酮康唑?qū)YP3A1活性有顯著的抑制作用,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與之前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相符。應(yīng)用HPLC測定CYPP450活性對新藥臨床藥物安全性評價(jià)和藥物相互作用研究具有重大意義。藥物對CYP450的誘導(dǎo)或抑制是臨床發(fā)生藥物間相互作用的一種重要原因和方式,一般來說,酶抑制作用的臨床意義大于酶促作用,約占全部相互作用的70%,了解藥物對CYP450抑制作用,有助于評價(jià)藥物安全性,指導(dǎo)臨床合理聯(lián)合用藥,同時(shí)應(yīng)注意避免藥物相互作用的發(fā)生,減少藥物不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上