菠菜葉mdna提取及rapd分析

菠菜是屬于波斯的一個(gè)科。它是一種一級(jí)植物，來(lái)自波斯。最初，摩爾人引進(jìn)西班牙，然后在歐洲廣泛傳播，并于公元647年在中國(guó)引入。菠菜依據(jù)葉型和種子是否有刺可分為有刺種(又稱(chēng)尖葉種)和無(wú)刺種(又稱(chēng)圓葉種)兩大類(lèi);依據(jù)季節(jié)可分為春菠菜、夏菠菜、秋菠菜和越冬菠菜。研究取得品種為越冬菠菜,取材后存于硅膠中保存。菠菜營(yíng)養(yǎng)成分極其豐富,富含維生素A、維生素C及礦物質(zhì),尤其維生系A(chǔ)、維生素C含量是所有蔬菜類(lèi)之冠,人體造血物質(zhì)鐵的含量也比其它蔬菜為多,對(duì)于胃腸障礙、便秘、痛風(fēng)、皮膚病、各種神經(jīng)疾病、貧血確有特殊食療效果。對(duì)解酒毒及防止齒槽膿漏現(xiàn)象亦具有食療神效。常食菠菜,具有通便清熱、理氣補(bǔ)血、防病抗衰等功效,它對(duì)各種貧血癥和糖尿病、肺結(jié)核、高血壓、風(fēng)火赤眼等諸多疾病可起輔助治療作用。由此,隨著人們生活質(zhì)量的提高,對(duì)優(yōu)良品種的菠菜需求量日益增大。分子標(biāo)記,其以個(gè)體間遺傳物質(zhì)的核苷酸序列變化為基礎(chǔ)的理想的遺傳標(biāo)記,是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映,基于DNA擴(kuò)增(PCR)的標(biāo)記,目前存在RAPD、AFLP、SSR和ISSR等,其中以RAPD是目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphficDNA)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA,作為一種以Williams和Welsh等提出的以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記技術(shù),它以隨機(jī)引物(一般為8~10bp),在DNA聚合酶的作用下,通過(guò)PCR反應(yīng)程序非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段,然后用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。進(jìn)而反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。因此,RAPD可用于對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜;并且,此技術(shù)準(zhǔn)確性較高,具有不受樣本器官發(fā)育時(shí)期特異性等突出優(yōu)點(diǎn),是非常有潛力的一種分析方法。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谝圆げ巳~為材料,采用差速離心法進(jìn)行線粒體的分離,以SDS法提取mtDNA,以期得到高質(zhì)量的mtDNA來(lái)達(dá)到RAPD反應(yīng)體系的需要,本研究選取30個(gè)引物進(jìn)行隨機(jī)引物多態(tài)性擴(kuò)增,對(duì)提取的mtDNA進(jìn)行了RAPD分析,得出數(shù)據(jù)。初步建立菠菜葉片mtDNA的多態(tài)性圖譜,為進(jìn)一步的菠菜雄性不育系與菠菜mtDNA的關(guān)系相關(guān)研究提供可行、可靠的依據(jù)。1材料和方法供試材料取自沈陽(yáng)師范大學(xué)農(nóng)菜示范基地,即圓葉菠菜、尖葉菠菜和荷蘭菠菜。1.2普析通用儀器有限責(zé)任公司、高速冷凍離心所設(shè)PCR儀:MG96G,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司、紫外分光光度計(jì):T6新世紀(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司、高速冷凍離心機(jī):GL-20G-II,上海安亭科學(xué)儀器廠、顯微成像系統(tǒng)、超凈工作臺(tái)、電泳儀、電子天平、高壓滅菌鍋、低溫冰箱、烘干箱、微量移液槍、酒精燈、離心管、吸管、量筒、三角瓶、細(xì)繩、牛皮紙、燒杯、液氮、硅膠、冰壺。1.3試驗(yàn)藥物(1)s-hcl-純化試劑β-疏基乙醇:Amresco-0482、瓊脂糖、FDA、溴化乙錠(EB)、TAE緩沖液、DNAMark-er。SDS提取液:25mmol/LTris-HCl,20mmol/LEDTA,0.5%SDS,pH8.0。純化試劑:氯仿、異戊醇、異丙醇。隨機(jī)引物(上海生工生物工程股份有限公司)dNTPs(上海生工生物工程股份有限公司)緩沖液A:50mmol/LTris-HCl,1.3mol/LNaCl,25mmol/LEDTA,0.2%BSA,0.05%半光氨酸,0.5%β-疏基乙醇,pH8.0。緩沖液B:400mmol/L蔗糖,50mmol/LTris-HCl,0.1%BSA,pH8.0。1.4測(cè)試方法1.4.1制備增菌劑及色譜梯度(1)取新鮮的菠菜幼葉1~3g,蒸餾水洗滌2~3次,放入陶瓷研缽中,加入適量的液氮,快速研磨破碎組織。過(guò)濾回收。(2)將濾液分裝于10mL無(wú)菌離心管中,1000g,離心10min。(3)將上清液轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌離心管中,離心15min,離心力分為2000g、2600g、3000g3個(gè)梯度,每個(gè)梯度2管。(4)將上清液轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌離心管中,離心15min,離心力分為18000g和20000g2個(gè)梯度,每個(gè)梯度3管(見(jiàn)表1)。(5)棄上清液,回收粗線粒體。1.4.2檢測(cè)分離層的制備(1)向線粒體沉淀中加入3~5mL的預(yù)冷緩沖液A,搖勻、懸浮沉淀,18000g離心15min,棄上清液,回收線粒體。(2)向沉淀中加5U/μL的DNaseI1μL,10×buffer2μL,三蒸水97μL,充分混勻,37℃溫育1h。(3)加1mL0.5mol/LEDTA,pH8.0,混勻靜置10min,終止反應(yīng)。(4)加入2mL緩沖液B,18000g離心15min,棄上清液,回收無(wú)污染的線粒體［4－6］。1.4.3提取mtda的方法1.4.3.ctab法常用DNA提取方法為CTAB法和SDS法。對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物和多糖物質(zhì)多的植物通常采用CTAB法,因其對(duì)于這些雜質(zhì)的去污效果要好;但CTAB法耗時(shí)過(guò)長(zhǎng),操作復(fù)雜。在本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)獲得較純線粒體的前提下,且根據(jù)線粒體的物質(zhì)組成主要為水、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸,因而選擇相對(duì)用時(shí)短,操作簡(jiǎn)便的SDS法來(lái)提取菠菜mtDNA。1.4.3.rnasea,3234和324.3(1)向沉淀中加入1mL預(yù)熱的提取液,加入0.5%β-疏基乙醇,65℃水浴1h,每間隔5min搖動(dòng)一次。(2)加入等體積氯仿:異戊醇(24∶1)混勻,12000r/min離心5min,用寬槍頭取上清液。(3)加入兩倍體積的-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇,-20℃靜置2h,12000r/min離心5min,棄上清液。(4)用適量的70%乙醇洗滌沉淀,4℃12000r/min離心5min,棄上清,重復(fù)此步驟。(5)將沉淀充分干燥后,溶于適量的(30μL左右)TE,加入1%體積的10mg/mL的RNaseA,37℃靜置1h。-20℃保存,備用。1.4.3.物鏡下觀察取2μL所提取的線粒體,以緩沖液B稀釋20倍后,取少量于100倍物鏡下觀察。取少許稀釋液加入熒光素染色,于倒置熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)線粒體活性。1.4.3.測(cè)定及純度分析取1μLmtDNA樣品,加三重蒸餾水稀釋至99μL,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280數(shù)值及mtD-NA濃度,并進(jìn)行純度分析。取5μLmtDNA樣品,0.8%瓊脂糖凝膠電泳40min(電壓100V),檢測(cè)mtDNA完整性［7－9］。1.4.3.pcr擴(kuò)增程序RAPD反應(yīng)體系為0.1mol/LdNTP、2mol/LMgCl2、0.4μmol/L引物、1.5UTaq酶、25ngmtD-NA,總體系為25μL/管。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3min1個(gè)循環(huán);94℃1min、37℃1min、72℃2min45個(gè)循環(huán);72℃5min1個(gè)循環(huán);保存溫度4℃。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中,10V下電泳40min［10，11］。2結(jié)果分析2.1fpsg的生成熒光素FDA(二乙酸熒光素)是一種熒光染色劑,它本身沒(méi)有熒光。在進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)之后經(jīng)非特異性脂酶催化,FDA生成熒光素,熒光素經(jīng)480nm激光激發(fā)發(fā)出黃綠色熒光。熒光素可被有活性的線粒體滯留,線粒體死亡或膜結(jié)構(gòu)受損熒光素很快擴(kuò)散出線粒體,則不能觀察到帶有綠色熒光的線粒體。在試驗(yàn)中,于100倍鏡下可觀察到橢圓形線粒體。線粒體在熒光顯微鏡下呈黃綠色,約有89%的線粒體完整,且具有活性(圖1)。2.2rapd分析法檢測(cè)最佳dna的質(zhì)量及產(chǎn)量通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品,結(jié)果表明:差速離心法提取的mtDNAA260/A280,均介于1.757~2.697之間,樣品污染程度較低,所得高質(zhì)量的mtDNA能夠滿足RAPD分析的要求;此方法平均每克菠菜葉片可以提取mtDNA19.8~23.5μg,mtDNA提取量取決于菠菜葉片的老嫩程度,葉片新嫩容易破碎,其嫩葉的DNA質(zhì)量和產(chǎn)量都較高,尤其污染相對(duì)較低。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mtDNA完整性。得到的樣品帶型清晰,無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖2)2.3rapd分析確定三種篩選引物及其范圍本次實(shí)驗(yàn)提取圓葉菠菜、尖葉菠菜和荷蘭菠菜(編號(hào)分別為:1、2、3)的mtDNA為材料進(jìn)行隨機(jī)引物的篩選,對(duì)30條隨機(jī)引物進(jìn)行初篩,擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)兩次,選擇多態(tài)性好且擴(kuò)增重復(fù)性高的隨機(jī)引物為宜,篩選出4條隨機(jī)引物,即S7、S16、S21、S24,隨后對(duì)三種供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,記錄數(shù)據(jù),進(jìn)行RAPD分析(圖3)。其中,引物S7:1號(hào)、2號(hào)材料沒(méi)有條帶產(chǎn)生,3號(hào)材料有條帶產(chǎn)生,可視為3號(hào)材料的特異性條帶;引物S16:1號(hào)材料沒(méi)有條帶產(chǎn)生,2號(hào)材料和3號(hào)材料條帶位置相同,僅可以區(qū)分1號(hào)材料;引物S21:3種材料均有條帶產(chǎn)生,2號(hào)材料和3號(hào)材料的條帶位置相同,僅可以區(qū)分1號(hào)材料。以上3種引物無(wú)法區(qū)分3種供試材料,只有引物S24,1號(hào)材料和2號(hào)材料有條帶產(chǎn)生,且位置不同,3號(hào)材料沒(méi)有條帶產(chǎn)生,能夠特異性的對(duì)三種菠菜種類(lèi)進(jìn)行種類(lèi)鑒定。