單味五葉草莓醇提物對(duì)s

5葉草（又名泡沫和種子泡沫，當(dāng)?shù)厝艘脖环Q(chēng)為“白泡沫”、“地衣”和“白草莓”）屬于薔薇科草科多年生草本植物。是秦嶺山區(qū)的野生植物。對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求很低，很容易收獲。這里有豐富的資源，可以作為蔬菜和葡萄酒。當(dāng)?shù)孛耖g草醫(yī)常用其全草煎服治療胃脘痛、腹腔腫塊、小便不通、噎膈等病,每獲良效。筆者根據(jù)民間應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),將五葉草莓全草粉碎裝膠囊試用于消化道腫瘤(胃癌、食道癌、大腸癌、肝癌)及前列腺癌等疾病的治療,對(duì)于縮小瘤體、緩解及改善全身癥狀,提高患者生活質(zhì)量等方面有著極顯著的效果。本課題擬通過(guò)對(duì)S180荷瘤小鼠VEGF、bFGF的檢測(cè)分析,觀察五葉草莓醇提物對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤血管新生指標(biāo)影響,試探討五葉草莓抗腫瘤效果及可能的作用機(jī)制,為腫瘤的防治提供新的思路與途徑。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方程選用健康雄性SPF昆明種小鼠50只,年齡4～9周,體重19～22g,由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SGXK(陜)2007-001。1.2腫瘤植株S180瘤株由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3給藥、試劑和機(jī)器1.3.1強(qiáng)化系統(tǒng)溶劑法五葉草莓,采購(gòu)自陜西秦嶺山區(qū),經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生藥教研室胡本祥教授鑒定為薔薇科植物五葉草莓F.pentaphyllaLozinsk.的全草,本藥為正品。用系統(tǒng)溶劑法對(duì)五葉草莓進(jìn)行提取和粗分離,得浸膏,用生理鹽水將浸膏稀釋,高劑量組按生藥量計(jì)算為8.26g·kg-1·d-1低劑量組按生藥量計(jì)算為4.13g·kg-1·d-1,配好溶液備用。環(huán)磷酰胺注射液(CTX)(山西普德藥業(yè)有限公司,批號(hào):H14023686)1.3.2試劑乙醇,兔抗VEGF免疫組化染色試劑盒、兔抗bFGF免疫組化染色試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色劑由博奧康醫(yī)藥公司提供。1.3.3儀器、儀器和儀器GTK-2002自動(dòng)恒溫?cái)偪胶嫫瑱C(jī)(西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司),ZMN-7803自動(dòng)組織包埋機(jī)(西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司),LQ-A包埋蠟塊修整儀(西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司),YABO600電腦自動(dòng)脫水機(jī)(常州市雅博電子設(shè)備有限公司),Motic顯微鏡及照相系統(tǒng)(Motic公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);電熱恒溫水浴箱(北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠);循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠);電子天平(撫順宇辰衡器有限公司),手術(shù)刀,止血鉗,試管等。2方法2.1動(dòng)物分組、模型制備與觀察所有小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)7天,后將在無(wú)菌條件下接種7天的荷瘤S180腹水瘤小鼠的腹水與PBS液按1∶3的比例進(jìn)行稀釋,離心后棄上清液,并用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞[(2～3)×107個(gè)/mL],用臺(tái)盼藍(lán)溶液染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),若活細(xì)胞率>95%后,在小鼠左腋皮下注射0.2mL稀釋液,制成實(shí)體瘤模型。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》將上述已接種S180腹水型肉瘤的昆明種鼠,于接種24h后隨機(jī)分成4組,為空白組、模型組、CTX組、五葉草莓高、低2個(gè)劑量組共5組,各組體重?zé)o明顯差異。模型組根據(jù)體重按0.2mL/10g用生理鹽水灌胃1次,環(huán)磷酰胺(CTX)按0.04g/kg每天腹腔注射1次,高劑量組按生藥量計(jì)算為8.26g·kg-1·d-1,用生理鹽水將浸膏稀釋,予0.4mL/只/日灌胃,低劑量組按生藥量計(jì)算為4.13g·kg-1·d-1,用生理鹽水將浸膏稀釋,予0.4mL/只,灌胃,日1次。毛色,精神,行動(dòng),進(jìn)食水等一般情況觀察。接種14天后小鼠脫臼處死,分別稱(chēng)取小鼠體重,解剖瘤體、脾、胸腺,分別稱(chēng)重,個(gè)別組出現(xiàn)提早死亡的動(dòng)物則提前解剖稱(chēng)重紀(jì)錄。計(jì)算抑瘤率、瘤/體比、脾/體比、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)等。抑瘤率=(C-T)/C×100%T為實(shí)驗(yàn)組平均瘤重,C為對(duì)照組平均瘤重。胸腺指數(shù)=胸腺重/體重,脾臟指數(shù)=脾臟重/體重。2.2血管內(nèi)生長(zhǎng)因子vegf和堿性纖維生長(zhǎng)因子bfgf的測(cè)定2.2.1樣品提取接種14天后斷頸脫臼處死荷瘤小鼠解剖瘤體,稱(chēng)重后置于4%多聚甲醛中固定24～48h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,留做免疫組化。2.2.2動(dòng)物群中vegf抗體檢測(cè)將組織切片置于二甲苯中浸泡10min,更換二甲苯再浸泡10min,常規(guī)脫蠟,100%、95%、80%、70%酒精梯度水化,蒸餾水充分浸洗;3%H2O2室溫下封閉30min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,0.01MPBS(后同)洗10min,2次;滴加正常山羊血清封閉工作液,置濕盒中37℃孵育1h,甩去多余液體,勿洗;滴加適當(dāng)稀釋的VEGF抗體(工作濃度為1∶300),置濕盒中37℃孵育1h,4℃過(guò)夜;復(fù)溫至37℃,PBS洗10min,2次;滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgC,PBS洗10min,2次;DAB顯色,70%、80%、95%、100%酒精依次梯度脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。分別以抗體稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照,在清晰的背景上出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒者為陽(yáng)性,在Motic顯微鏡下照相,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像處理分析技術(shù)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析,通過(guò)MoticDigilabii網(wǎng)絡(luò)版數(shù)碼顯微鏡互動(dòng)教室進(jìn)行彩色圖文分析,測(cè)定免疫反應(yīng)產(chǎn)物VEGF蛋白的平均光密度、積分光密度及平均灰度值,以備統(tǒng)計(jì)分析。2.3聚甲醛染色隨機(jī)取各組小鼠S180瘤塊組織標(biāo)本,經(jīng)4%多聚甲醛固定24h,經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸臘、包埋,切片HE染色,光鏡下觀察并拍照,并對(duì)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞種植部位侵襲程度進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法s:單次使用ss各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用多樣本方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1葉草莓高、低劑量組1.見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)證明各組均有一定的抑瘤作用,以CTX組最為明顯,抑瘤率達(dá)到51.69%;五葉草莓高、低劑量組抑瘤率分別為45.05%和37.77%(P<0.01)。五葉草莓低劑量組與CTX組比較差異顯著(P<0.05)。3.2兩組比較顯著性差異見(jiàn)表2。胸腺指數(shù):空白組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)脾臟指數(shù):五葉草莓高劑量組、空白組的與模型組比較有顯著性差異(P<0.01);CTX組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05);五葉草莓高、低劑量組與CTX組比較,CTX、五葉草莓高劑量組、五葉草莓低劑量組與空白組比較,胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均無(wú)明顯差異(P>0.05),但CTX組P值較小,說(shuō)明中藥五葉草莓對(duì)胸腺及脾臟有一定的保護(hù)作用,對(duì)免疫器官影響小于CTX。3.3小鼠光密度與vegf蛋白表達(dá)的關(guān)系灰度系指圖像每一像素的明暗(深淺)程度,即該像素的圖像由黑到白變化的量化等級(jí)?；叶戎档拇笮∨c物質(zhì)含量多少呈反比關(guān)系,灰度值越小,表示染色越深,所含物質(zhì)的量越多。光密度又稱(chēng)吸光度,是指光線(xiàn)通過(guò)某一物質(zhì)前與通過(guò)后光強(qiáng)度比值的對(duì)數(shù)值。光密度值與物質(zhì)含量成正比關(guān)系,光密度值越小,說(shuō)明光線(xiàn)被吸收的程度小,物質(zhì)含量則越低。五葉草莓VEGF、bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤組織中呈高表達(dá),環(huán)磷酰胺及五葉草莓各劑量組可降低VEGF蛋白表達(dá),其中VEGF與模型組相比有顯著差異(P<0.01)。具體如表3～4所示。3.4環(huán)磷酰胺組表現(xiàn)肉瘤組織經(jīng)HE染色,鏡下觀察(見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖1),可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞侵犯肌層,瘤組織呈片狀生長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞密集排列,細(xì)胞大小不同,形態(tài)各異;細(xì)胞核大小不一,核質(zhì)比例增大;染色質(zhì)呈顆粒狀,分布不均勻,可見(jiàn)不對(duì)稱(chēng)性,多極性核分裂等病理性核分裂象,瘤體周?chē)袕V泛水腫、出血,大量新生血管形成。環(huán)磷酰胺組有大片的細(xì)胞壞死區(qū),較多新生血管形成。五葉草莓高、低組均可見(jiàn)到不同程度的片狀壞死區(qū),瘤組織內(nèi)及其周?chē)⒀芫鶞p少。4葉草莓vegf和bfgf蛋白在小鼠腫瘤中的抑瘤作用在實(shí)體瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中,持續(xù)的血管生成是一個(gè)關(guān)鍵因素。新生的微血管是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的第一站,腫瘤微血管數(shù)量越多,腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)會(huì)就越大,轉(zhuǎn)移概率越大。死亡的幾率也會(huì)大大增加。血管新生指在原有的毛細(xì)血管和/或微靜脈基礎(chǔ)上通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、黏附和形成管腔樣結(jié)構(gòu)等,最終形成有功能的新血管的過(guò)程。惡性腫瘤生長(zhǎng)經(jīng)歷兩個(gè)階段:血管前期和血管期。在血管前期,惡性腫瘤主要通過(guò)彌散作用獲取氧氣及營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)惡性腫瘤生長(zhǎng)到2mm3之后即處于血管期,其生長(zhǎng)絕對(duì)依賴(lài)于血管新生,腫瘤組織之所以生長(zhǎng)迅速易于轉(zhuǎn)移,是因?yàn)椴粩喈a(chǎn)生的大量新生血管提供了豐富的血液供應(yīng)。通過(guò)抑制血管新生,進(jìn)而抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)已經(jīng)成為目前腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn),并為篩選抗腫瘤藥物和探求其抗癌機(jī)理開(kāi)辟了新的途徑、新的思路。在眾多與血管形成相關(guān)的因子中,腫瘤細(xì)胞自分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)是兩個(gè)最主要促血管生成因子,在腫瘤中的表達(dá)常被作為評(píng)估抗腫瘤血管生成劑的重要指標(biāo)。此二者通過(guò)與特異受體結(jié)合促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,最終形成新生血管。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)的檢測(cè),探討五葉草莓抑瘤可能的作用機(jī)制。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們得知:CTX組及五葉草莓高、低劑量組的抑瘤率分別為51.69%、45.05%、37.77%,提示環(huán)磷酰胺的抑瘤率最高