菊花莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)研究

以菊花莖尖和莖段為外植體，以不同激素水平的培養(yǎng)基誘導醫(yī)傷組織、叢生芽和根系，完成植物的再生。所有再生植株的生長過程都是在無菌條件下進行的，因此可以獲得無病植物。作者以不同質(zhì)量濃度的細胞分裂素和生長素作為材料菊花的生長環(huán)境，培育出無病植物，并利用快速繁殖技術(shù)培育出大量植物。這將概括如下。1材料和實驗方法實驗在內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院組織培養(yǎng)實驗室進行.實驗材料選用引種于陜西的菊花(Denderotemamorifolium)(別名九月菊),該花具有較高的觀賞價值,適于切花及盆栽,具有一定的藥用價值,也可食用養(yǎng)生,適于大面積推廣種植.實驗中組織培養(yǎng)過程使用MS培養(yǎng)基,生長素使用萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA);細胞分裂素使用6-芐氨基嘌呤(6-BA).利用不同種類、不同質(zhì)量濃度的激素研究最適于菊花組織培養(yǎng)的條件.1.1消除試驗植株,將植株中的病原菌消除,重新再生植株無性繁殖作物,極易受到一種或一種以上的病毒(如菊花葉斑病、菊花白粉病)的周身侵染,獲得無病植株的唯一方法就是該植株的營養(yǎng)部分把病原菌消除,并由這些組織中再生完整植株.1.1.1培養(yǎng)基生產(chǎn)本次實驗采用MS培養(yǎng)基(表1),再加入生長素萘乙酸(NAA)或吲哚乙酸(IAA)和細胞分裂素6-芐氨基嘌呤(6-BA).1.1.2材料消毒和消毒因為本次實驗的目的是為脫去菊花本身帶有的病毒,所以在材料的選取與消毒上是非常嚴格的.在溫室中選取生長健壯的菊花,剪下其莖尖段,放入無菌容器內(nèi)封口.在無菌室內(nèi)或超凈工作臺上將材料取出,用清水反復(fù)沖洗4~5次,洗去表面的泥土與雜質(zhì),然后將洗凈的材料放到75%的酒精溶液中消毒,消毒時間為30~60秒.然后用蒸餾水洗凈,再將材料放入10%的漂白粉濾液消毒8分鐘,再用無菌水沖洗3~5次,濾紙吸干.再將材料轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液消毒,不低于5分鐘,再用無菌水沖洗3~5次,濾紙吸干.最后將材料放入無菌的三角瓶中封口待用.1.1.3實驗材料的制備在超凈工作臺上,將滅過菌的材料放入無菌培養(yǎng)皿中,用解剖針剝?nèi)タ梢姷纳L點,周圍可見的小葉在解剖鏡下只剩下1~2個葉原基,取下只有0.2~0.3mm生長點,放入提前做好的培養(yǎng)基中培養(yǎng).然后將裝有材料的培養(yǎng)基放入光照箱中進行培養(yǎng).要求在黑暗或散射光下培養(yǎng),溫度28℃.待培養(yǎng)外植體出現(xiàn)愈傷組織后更換培養(yǎng)基,對其進行繼代培養(yǎng).并在光照燈下補充光照,光照強度1000~4000Lx,溫度23~25℃.待出芽后將其轉(zhuǎn)入到另外的生根培養(yǎng)基中促使生根.本次實驗過程使用不同種類、不同質(zhì)量濃度的激素對菊花進行脫毒培養(yǎng).每組實驗材料均為25份.過程如表2.1.1.4葉片的生長對生根的植株少量繁殖并進行脫毒率的鑒定.采用病毒的汁液感染法.由受檢植株上取下葉片,置于等容積(W/V)的緩沖液(0.1mol/L磷酸鈉)中,用研缽體和研桿將葉片研碎.在指示植物(本次實驗采用萬壽菊)的葉片上滴上此溶液,觀察1周后得到結(jié)果.1.1.5苗木栽植方法移栽是植株從培養(yǎng)基中向土壤中轉(zhuǎn)移的過程,也是植株從異養(yǎng)向自養(yǎng)的轉(zhuǎn)變.更是此次實驗是否適于廣泛的投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要保證.幼苗移栽前先煉苗2~3天,即移栽前先把培養(yǎng)基瓶的塞子打開,放在25℃左右的溫室中,增加組培苗對外界環(huán)境的適應(yīng)能力.移栽時仔細洗去附著在幼苗上的培養(yǎng)基,然后移植于適宜的基質(zhì)中,澆足定根水,蓋上薄膜保持溫度,避免陽光直射,并注意通風換氣,溫度控制在18~20℃.1~2周后揭掉薄膜,每隔3~5天葉面噴施營養(yǎng)液,1個月即可上盆或定植于田間,本此實驗共移栽植株17棵,最后上盆5棵,成活率達到29%.1.2快速繁殖根據(jù)植物細胞的全能性,在短時間內(nèi)將體細胞培養(yǎng)出大量植株,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著非常大的推廣潛力與意義.1.2.1實驗材料的選擇選取在脫毒實驗中成功移栽上盆而且長勢健壯的植株作為實驗材料,從而培養(yǎng)出大量的無病植株.在外植體的選擇上,根據(jù)菊花的生理特征,選取莖作為實驗材料.1.2.2升汞和酒精處理選取生長健壯莖洗去表面泥土,在超凈工作臺,用75%酒精處理20~30秒,再用無菌水沖洗3~5次,轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液浸泡8~10分鐘,再用無菌水沖洗4~6次,用濾紙吸干水分.1.2.3培養(yǎng)基的選擇在無菌條件下,用剪刀將外植體切割成大小適宜的小塊(莖段切成0.5~1cm長小段)然后按極性方向直立插入初代培養(yǎng)基中,深約2~3mm,接種完成后即轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室進行初代培養(yǎng),培養(yǎng)溫度22~28℃,光強1000~4000Lx.當外植體產(chǎn)生愈傷組織后,再將置于培養(yǎng)基中的外植體取出,轉(zhuǎn)移到續(xù)代培養(yǎng)基中,關(guān)于續(xù)代培養(yǎng)基的選擇和初代培養(yǎng)基相同或適當降低濃度.再將繼代培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室進行光照培養(yǎng),培養(yǎng)溫度22~25℃,光強2500~4000Lx,當培養(yǎng)基中的植株出芽后,再將其轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中,誘導其生根.此階段保持繼代培養(yǎng)時的溫度與光強,直至其生根.本次實驗的過程如表3(每組均為25份).1.2.4及時種植和保證陽光這次移栽采用與上次相同的方法,為將由于人為因素造成的誤差降到最低,一定要保持室內(nèi)溫度并保證陽光與通風,本次實驗共移栽幼苗12棵,最后成活上盆3棵,成活率達到25%.2結(jié)果與分析2.1g/liaa環(huán)境效果在菊花的脫毒與快繁的兩次培養(yǎng)過程中,將滅菌的材料接種在MS培養(yǎng)基+不同濃度的生長素(NAA或IAA)與一定濃度的細胞分裂素(1mg/L6-BA)中,經(jīng)1周左右的誘導,在1mg/LIAA環(huán)境中的效果最好,具體表現(xiàn)為出現(xiàn)愈傷組織的時間短,成活率高;將分化初愈傷組織的外植體分別接種在MS+0.8mg/LIAA+1mg/L6-BA(培養(yǎng)基1),MS+0.4mg/LIAA+1mg/L6-BA(培養(yǎng)基2),MS+0.8mg/LNAA+1mg/L6-BA(培養(yǎng)基3),MS+0.4mg/LNAA+1mg/L6-BA(培養(yǎng)基4)培養(yǎng)基上,經(jīng)1周左右繼代一次.從表4看出植株在生長素濃度相同情況下,IAA提高了苗的繁殖系數(shù),且苗的生長狀況也隨之變化.在相同生長素的情況下,濃度較高的效果最好.2.2iaa和naa對菊花的生根將1~2cm高的幼苗分別轉(zhuǎn)入1/2MS+1mg/LIAA(培養(yǎng)基A)、1/2MS+0.5mg/LIAA(培養(yǎng)基B)、1/2MS+1mg/LNAA(培養(yǎng)基C)、1/2MS+0.5mg/LNAA(培養(yǎng)基D)培養(yǎng)基中.10~15天形成根的突起,15天的生根率分別為62%、14%、35%、0,從表5可以看出同一質(zhì)量濃度的IAA對菊花的生根較NAA好.3組培養(yǎng)成分分析本研究以菊花莖尖作為外植體,利用植物生理特點在培養(yǎng)基中獲得無病植株,脫毒后苗有明顯的生長優(yōu)勢,主要表現(xiàn)為植株粗壯、葉片寬大等.待無病植株成苗后再利用快繁技術(shù)大量繁殖.誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)菊花成苗時間為15~30天,這不僅比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法2~6個月大大縮短了時間,而且通過快繁技術(shù)增大了繁殖系數(shù).在田間生產(chǎn)情況下,菊花生長繁殖較快,說明其含有較高的內(nèi)源激素.本研究結(jié)果也反映出較高濃度的IAA與6-BA的配比對菊花有促進生長的作用,在適宜的培養(yǎng)基中,葉片舒展寬大,葉色較深、脆性小、生長速度快.而低濃度的NAA或IAA與6-BA配比使菊花的生長滯化,甚至