熊果酸對酮康唑小鼠肝毒作用的影響

酮康唑（ketoconamole，ket）是一種廣泛用于表皮和深層真菌感染的廣昌合物。近年來，它也被用于治療冠狀動脈粥樣硬化和其他疾病。酮康唑引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)很多,尤其是導(dǎo)致肝損害,一直受到廣泛的重視。目前尚無有效的藥物治療酮康唑引起藥物性肝炎。熊果酸(Ursolicacid,UA)為一種五環(huán)三萜酸類化合物,在自然界分布很廣,如存在于熊果(杜鵑花科)葉、果實(shí)中和女貞(木樨科)的葉中。業(yè)已證明,熊果酸可以降低由CCl4、乙酰氨基酚、氯化鎘所致小鼠肝損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)旨在探討熊果酸對酮康唑肝臟毒性的干預(yù)作用及可能的機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1劉耕陶為正常熔點(diǎn)瓊脂糖pi酮康唑由西安楊森制藥公司提供,批號:040202347;熊果酸由湖北李時珍藥業(yè)有限公司提供;雙環(huán)醇(Bicychol)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉耕陶院士惠贈;正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)和低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)(Amresco);碘化丙啶(PI)(Sigma);其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.2儀器、檢測方法:hmias-2000在云圖熒光顯微鏡(OlympusPM-10ADS光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)),HMIAS-2000高清晰彩色圖文分析儀(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司),單細(xì)胞凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(IMI1.0),流式細(xì)胞儀(BeckmanEpicsAltra)。1.1.3實(shí)驗(yàn)動物健康雌性昆明種小鼠,體重20-24g,武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:SCXP(鄂)2003-0004。1.2方法1.2.1給藥劑量及給藥時間動物隨機(jī)分為5組,每組8只,分別為空白對照組、酮康唑組[100mg/(kg·d)灌胃給藥×21d]、酮康唑合用熊果酸低劑量組及高劑量組[100mg/(kg·d)灌胃給藥;400mg/(kg·d)灌胃給藥,×7d]、酮康唑合用雙環(huán)醇組[100mg/(kg·d)灌胃給藥×7d]。分別在酮康唑給藥14d后開始給藥。末次給藥后禁食12h,摘眼球取血,取肝臟備用。1.2.2血清生化指標(biāo)salt、sast、alp和總膽紅素til制備血清按試劑盒說明進(jìn)行檢測。1.2.3血糖值bgau，bgau葡萄糖氧化酶法,檢測波長546nm。1.2.4肝糖原含量hepachgagoggogogg蒽酮顯色法,檢測波長620nm。1.2.5細(xì)胞裂解法檢測聚苯胺凝膠電泳單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)。制備細(xì)胞懸液,在PBS中調(diào)整至所需細(xì)胞濃度(1×106-5×106個/ml);離心2000ɡ×10min,45℃下鋪100μl1.1%常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于載玻片上;將細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠按體積比為6.5∶1混勻,取75μl滴于第1層凝膠上,加蓋玻片,4℃固化10min;再鋪第3層低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠;凝固后將載玻片放入新配制的細(xì)胞裂解液4℃避光裂解1h;避光解旋30min;然后25V,300mA,電泳30min;取出玻片,用0.4mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌后PI染色;熒光顯微鏡(激發(fā)波長510-560nm,濾過波長690nm)下觀察。1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞流式細(xì)胞小鼠放血斷頭處死,在1640培養(yǎng)液中剪碎肝臟,在300目尼龍篩網(wǎng)上研磨,過濾,取濾液,低速離心5min,棄去上層液體,細(xì)胞轉(zhuǎn)入試管中,再加入10mlPBS液,然后通過100目篩網(wǎng)過濾,去除細(xì)胞碎片,通過100目篩網(wǎng)去除細(xì)胞團(tuán)塊,將細(xì)胞懸液以70%乙醇固定,4℃過夜,RNA酶37℃消化30min,PI染色2h,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,流式細(xì)胞儀488nm處檢測。1.2.7陽性單位數(shù)、陽性染色面積百分?jǐn)?shù)、積分光度、平均粒度取最大葉肝固定于10%多聚甲醛中,石蠟包埋,HE染色觀察。每張切片在400倍鏡下隨機(jī)挑選10個視野,用圖像分析軟件定量測量陽性單位數(shù)、陽性染色面積的百分?jǐn)?shù)、積分光度、平均灰度。測量結(jié)果取均值,各組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1熊果酸對酮康唑血清酶、總膽紅素和肝指數(shù)的影響2.2血糖水平和肝糖原含量2.3流式細(xì)胞儀分析2.4歐洲氟水2.2病理觀察3熊乳酸對酮康唑引起肝臟毒性的影響在某些慢性肝病中肝細(xì)胞凋亡引起細(xì)胞的損傷可能起主要作用。咪唑類抗真菌藥不良反應(yīng)中,肝功能異常最為常見,甚至引起暴發(fā)性肝衰竭危及生命。肝細(xì)胞大量凋亡被認(rèn)為是暴發(fā)性肝衰竭的重要發(fā)病機(jī)制之一。有研究證實(shí)酮康唑可引起細(xì)胞核內(nèi)P53蛋白堆積從而誘導(dǎo)多種人癌細(xì)胞和原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酮康唑引起小鼠肝臟損傷不僅表現(xiàn)為血清酶的增高、肝糖原流失和大量脂質(zhì)堆積,同時肝細(xì)胞增殖周期分布發(fā)生明顯變化,G2/M期阻滯,細(xì)胞凋亡增多(P<0.01)。肝臟是脂質(zhì)代謝的樞紐器官。脂肪酸、膽固醇、載脂蛋白、磷脂均在肝臟合成。慢性肝臟疾病往往會導(dǎo)致脂質(zhì)的代謝異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酮康唑組小鼠肝臟脂質(zhì)成帶狀堆積,熊果酸能明顯減少脂質(zhì)堆積(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熊果酸對酮康唑引起小鼠肝臟損傷具有明顯保護(hù)作用,除表現(xiàn)為降低酮康唑所致小鼠血清ALT、AST、ALP升高,還可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞在各增殖周期的分布,G1/G0、S期增多,G2/M期減少,說明熊果酸能減少肝細(xì)胞G2/M期阻滯,降低凋亡率,促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。同時熊果酸對酮康唑引起肝細(xì)胞核DNA的斷裂損傷也有明顯的改善,并且能減少脂質(zhì)堆積和肝糖原的流失,恢復(fù)病理形態(tài)的改變。這一點(diǎn),為臨床上酮康唑肝毒性的解救提供了理論依據(jù)。因此,我們認(rèn)為熊果酸能減少酮康唑引起小鼠肝細(xì)胞凋亡,保護(hù)肝臟功能。其機(jī)制一方面可能與保護(hù)肝細(xì)胞DNA完整或有助于DNA修復(fù),改善細(xì)胞周期阻滯有關(guān);另一方面也可能與調(diào)節(jié)代謝紊亂減少脂質(zhì)堆積有關(guān)。與正常對照組大鼠相比,小鼠灌胃酮康唑21d后血清ALT、AST、ALP、和肝指數(shù)水平明顯明顯升高,提示酮康唑已造成小鼠肝臟細(xì)胞膜通透性增加、肝功能受損?？偰懠t素水平各組無明顯差異。400mg/(kg·d)熊果酸可顯著抑制肝小鼠血清ALT、AST、ALP,同時減少肝指數(shù)的增加(表1)。酮康唑模型組小鼠血糖均值比生理鹽水組升高15.3%,肝糖原含量減少為生理鹽水組的38.7%。熊果酸對酮康唑引起血糖水平升高和肝糖原含量減少有逆轉(zhuǎn)作用(表2)。與生理鹽水組相比,酮康唑組肝細(xì)胞凋亡增多(亞二倍體峰顯著升高),G0/G1期細(xì)胞比例下降,G2/M期比例升高(P<0.01)。與酮康唑組相比,熊果酸大小劑量組肝細(xì)胞凋亡率分別下降30%和46%,細(xì)胞增殖周期中各增殖時相細(xì)胞所占比例也得到改善(圖1)。生理鹽水組肝細(xì)胞核呈圓或橢圓,邊緣清晰。酮康唑組損傷的肝細(xì)胞核DNA斷裂片段泳出,在細(xì)胞后面形成長的拖尾,部分肝細(xì)胞核DNA散開成星云狀。熊果酸高低劑量組及雙環(huán)醇組有不同程度的恢復(fù)。熊果酸高劑量組對照組僅有極少彗星狀細(xì)胞出現(xiàn),拖尾較短(圖2)。肉眼觀察生理鹽水組小鼠的肝臟光滑紅潤,分為5葉,邊緣銳利;模型組小鼠肝臟顏色灰