鐵皮石斛的離體培養(yǎng)

蘭科是一種多年生草本植物，通常生長在潮濕的森林樹干和巖石上。目前發(fā)現(xiàn)了1500多種石斛蘭，76種在中國，39種在藥物中。鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo=DendrobiumcandidumWallichexLindley)是《中華藥典》中收載的5種石斛屬植物之一。石斛的藥用部分是新鮮或干燥莖,具有益胃生津、滋陰清熱的功效。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳,自然條件下需與某些真菌共生才能萌發(fā),很難用實(shí)生苗栽培;而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低,加上人為的過度采挖和破壞生境,其資源已瀕臨滅絕,被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物之一。近20年來,國內(nèi)學(xué)者對鐵皮石斛的組培研究非常重視[1~7],鐵皮石斛外植體原球莖的誘導(dǎo)率低,但原球莖增殖和分化容易,分化苗弱,生根苗伴大量叢生苗,移栽成活率低。筆者就外植體建立無菌系后,研究了無菌苗快速形成規(guī)模過程中相關(guān)技術(shù),著重控制培養(yǎng)條件,獲得優(yōu)良的原球莖,培育健壯的試管苗,相關(guān)研究內(nèi)容國內(nèi)未見報(bào)道。1材料和方法1.1ms+6-ba2.2.0-1/2.4將鐵皮石斛莖段誘導(dǎo)出的無菌苗依苗的高度分切成2~3節(jié),2個假鱗莖為一節(jié),切除過長的根系,留約1cm長的根,從根莖處將根、莖分開,莖以下稱為根蔸,以上為莖段。上述切段外植體分為帶頂芽的莖段、莖段和根蔸。原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:(1)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;(3)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(4)MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L;(5)MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L;(6)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L;(7)MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L。生根培養(yǎng)基:(1)1/2MS+NAA0.5mg/L;(2)1/2MS+NAA1.0mg/L;(3)1/2MS+NAA2.0mg/L;(4)1/2MS+IBA0.5mg/L;(5)1/2MS+IBA1.0mg/L;(6)1/2MS+IBA2.0mg/L;(7)1/2MS+NAA2.0mg/L+香蕉50g/L。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)基外植體誘導(dǎo)試驗(yàn)以基本培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)設(shè)計(jì)成三因素二水平的正交試驗(yàn),L4(23)表頭設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)基pH5.8,光照強(qiáng)度1500lx,光照時間12h/d,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,蔗糖濃度為30g/L。將根蔸、莖段和帶頂芽的莖段分別接入各誘導(dǎo)培養(yǎng)基,14d后開始觀察各外植體的生長、葉色變化、叢芽誘導(dǎo)和原球莖發(fā)生情況,以繁殖系數(shù)進(jìn)行正交分析。1.2.2原球莖重量用感量0.01g的托盤扭力天平分別稱取接入原球莖重量和調(diào)查期原球莖重量,每組培養(yǎng)基接7瓶,每瓶1g左右。用增殖質(zhì)量倍數(shù)(調(diào)查期原球莖重/始接原球莖重)、原球莖生長情況、分化能力為依據(jù)進(jìn)行評判。1.2.3原球莖生長情況接入增殖培養(yǎng)基中的原球莖分別放置于(23±1)℃、(25±1)℃、(27±1)℃,其它條件相同的環(huán)境中培養(yǎng),30d后調(diào)查原球莖生長發(fā)育情況,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析1.2.4生根、小苗分化及苗高選取大小相近的無菌試管苗植株,去除基部老化組織及生長的小根,接入生根培養(yǎng)基,放置于25~27℃和22~23℃溫度下進(jìn)行生根培養(yǎng),40d后觀察生根、小苗分化及苗高。將3cm以上的小苗,切除根后接入生根培養(yǎng)基,pH5.8。糖濃度20g/L,每處理10瓶,每瓶接10個小苗,接種后置于溫度為(23±1)℃,光照強(qiáng)度2000lx,光照時間12h/d的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。14d后開始觀察根的生長、萌動及伸長情況。40d后統(tǒng)計(jì)分析各處理生根率和每株根數(shù)。2結(jié)果與討論2.1鐵皮石斛叢芽誘導(dǎo)的正交分析40d后各類外植體均能誘導(dǎo)出叢芽或原球莖,誘導(dǎo)率達(dá)100%,以叢芽為主,原球莖較少(圖1)。正交分析結(jié)果(見表2)表明:影響鐵皮石斛叢芽誘導(dǎo)數(shù)量的主要因素是細(xì)胞分裂素6-BA的濃度,叢芽的發(fā)生數(shù)與6-BA濃度成反比,而與生長素NAA和鹽濃度的關(guān)系不大。鐵皮石斛叢芽誘導(dǎo)的最佳組合為:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。2.2叢芽的發(fā)生機(jī)制3類外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的表現(xiàn)各異,10d可以看到莖段和帶頂芽的莖段的葉片開始退色變黃,直至枯死脫落,莖段鮮綠,只有少數(shù)綠葉。帶頂芽的莖段也只剩頂部葉片,黃葉的脫落并不影響叢芽的發(fā)生,約15d后開始在各外植體的底部有不定芽產(chǎn)生,20d能明顯看到叢芽。莖段和帶頂芽的莖段只產(chǎn)生叢芽,且莖段產(chǎn)生的叢芽多于帶頂芽的莖段(表3),這可能是去除頂端優(yōu)勢后更利于叢芽形成的原因。以根蔸為外植體不僅誘導(dǎo)出大量的叢芽,而且伴生有原球莖的產(chǎn)生。以此培養(yǎng)基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L)進(jìn)行增殖培養(yǎng)時,原球莖的增殖率極高,分化苗的質(zhì)量和數(shù)量都非常理想(圖2)。2.3-ba對原球莖增殖的影響經(jīng)過40d的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛原球莖增殖受細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA的共同影響(見表4)。在合適的生長素存在下,6-BA對原球莖增殖存在小幅波動,呈先降后升的趨勢;在較低濃度下,隨6-BA濃度的增加,原球莖的增殖系數(shù)反而降低,隨著6-BA濃度的進(jìn)一步增加,原球莖的增殖加大,以后6-BA濃度增加而原球莖的增殖系數(shù)沒有明顯提高;6-BA濃度增加,增殖系數(shù)的離散性加大,原球莖的類型發(fā)生變化,含水翠綠色的原球莖增多,顆粒型的原球減少。在一定濃度的6-BA存在下,NAA的濃度與原球莖的增殖呈反比,而與球莖的死亡率呈正比。單一的細(xì)胞分裂素6-BA對原球莖的增殖不及附加適當(dāng)濃度NAA的協(xié)同作用。原球莖的增殖不僅與培養(yǎng)基激素的配比有關(guān),而且與原球莖的類型密切相關(guān),顆粒型、淺黃綠色的原球莖增殖系數(shù)小,分化好,而含水呈翠綠色的原球莖增殖倍數(shù)高,是前一種的2倍,但分化差。2.4溫度對原球莖增殖的影響培養(yǎng)30d后,溫度的高低與原球莖的增殖存在顯著差異(見表5),較高的溫度和較低的溫度都不利于原球莖的增殖,溫度過高原球莖增殖緩慢,原球莖的生長不適應(yīng),部分原球莖死亡。較低的溫度同樣表現(xiàn)為原球莖的增殖速度降低。原球莖在不同溫度中的增殖與原球莖的類型相關(guān),各處理表現(xiàn)出相似的結(jié)果,即含水翠綠原球莖增殖比顆粒淺黃綠色原球莖要快。2.5溫度對分生苗數(shù)量的影響在2種不同溫度下培養(yǎng)40d,鐵皮石斛表現(xiàn)出極高的分生能力,即使在生根培養(yǎng)時也不例外,在苗的基部或假鱗莖的節(jié)間都可能產(chǎn)生分生苗,并伴隨有氣生根,結(jié)果見表6。分生苗的多少與溫度密切相關(guān),溫度越高,分生苗的數(shù)量也越多。在不同溫度條件下,試管苗的平均根條數(shù)接近,無明顯差異;而生根苗的生長發(fā)育受到影響,在較低溫度下,生根苗更健壯,高大。2.6石斛對每株根的影響將高3cm以上的苗,接入以下生根培養(yǎng)基中,無菌苗開始表現(xiàn)出不適應(yīng),基部1~2葉片變黃,隨培養(yǎng)時間延長而脫落,其它葉片顏色慢慢轉(zhuǎn)綠,隨之根也從基部長出。在適宜的光溫條件下,15d左右可以看到有根從基部長出,隨時間的延續(xù),根也隨之伸長,每株根數(shù)增加,在根端上有根毛,根綠色而細(xì)長。40d后的石斛易生根,生長素有利于根的形成,其濃度與每株根條數(shù)呈正相關(guān);采用NAA的培養(yǎng)基略優(yōu)于IBA,附加香蕉泥有利于根的形成和每株根數(shù)的增加(見表7),同時根變得短而粗,根的色澤變淺,植株變得更粗壯(圖3、4)。2.7生根苗的移栽在適宜假植的季節(jié)(氣溫15~30℃)。將生根苗移到室外,作好遮陰,避免太陽直射,14d后打開瓶蓋煉苗,直至培養(yǎng)基表面有輕度污染,小心取出生根苗,洗凈根部培養(yǎng)基,再用多菌靈或甲基托布津1000倍液浸泡根部10min,自然通風(fēng)晾干至根系發(fā)白,移栽于已消毒的水苔或碎樹皮為基質(zhì)的小缽中,50%~70%遮陰,保持80%的濕度,細(xì)心管理,成活率能達(dá)90%以上(圖5)。3質(zhì)控措施:產(chǎn)生原球莖,增殖和分化鐵皮石斛的原球莖啟動相對較難,而原球莖的增殖和分化容易,少量添加植物激素,可獲得大量的分化苗,生產(chǎn)健壯的試管苗是移栽成活的關(guān)鍵。鐵皮石斛原球莖增殖過程中產(chǎn)生2種類型,原球莖的類型與增殖和分化密切相關(guān),具有高增殖倍數(shù)的含水翠綠型原球莖分化率較低