蕨類植物組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展

蕨類植物也被稱為羊齒草，起源于古代的志留紀(jì)和泥盆紀(jì)。在石炭系，他是植物界的主人，但在那之后，它大多消失，只有一部分發(fā)展成為現(xiàn)代蕨類植物。蕨類植物的分類地位介于苔蘚植物和種子植物之間,目前全世界約有12000多種,主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),中國有2600多種(秦仁昌,1959)。蕨類植物以其高雅飄逸的體態(tài)、碧綠青翠的葉片以及精致的脈序、孢子囊群的排列組合構(gòu)成的精美圖案,成為觀葉植物的一大類族。目前觀賞應(yīng)用的種類主要有:鐵線蕨(Adiantumcapillusveneris)、腎蕨(Nephrolepiscordifolia)、鳳尾蕨(Pteriscretica)、巢蕨(Aspleniumnidus)、鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)、鱗蓋蕨屬(Microlepia)、多足蕨屬(Polypodium)、骨碎補屬(Davallia)、旱蕨(Pellaeanitidula)和紫萁(Osmundajaponica)等(Olsen,2007)。蕨類植物具有明顯的世代交替,即大而復(fù)雜的二倍體孢子體世代(無性)和小而簡單的單倍體配子體世代(有性),無性世代和有性世代都可獨立生活;但占優(yōu)勢的是孢子體,即孢子體世代(陸樹剛,2007)。自然條件下,蕨類植物主要通過孢子進(jìn)行繁衍,或通過根、根狀莖、葉等部位產(chǎn)生無性芽孢和頂端分生組織產(chǎn)生新植株。然而,自然繁殖的蕨類植物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類的需求,而且近年來生境惡化及掠奪式的開發(fā)使蕨類資源急劇減少,甚至有些種類在原產(chǎn)地已經(jīng)滅絕(傅立國,1992)。組織培養(yǎng)已經(jīng)作為一種有效的快速繁殖手段運用于蕨類植物生產(chǎn)中,通過組織培養(yǎng)方式進(jìn)行繁殖對于一些無孢子或孢子量少、孢子不育的雜交種以及孢子繁殖困難的種類尤為適宜(石雷,2002)。此外,對于蕨類植物物種,尤其是瀕危物種桫欏(Alsophilaspinulosa)的保存也具有重要意義,利用無菌保存(配子體或孢子體)可以在不受自然條件影響下,在有限空間保存大量種質(zhì)資源。1pla對蕨類植物的細(xì)胞培養(yǎng)蕨類植物的組織培養(yǎng)主要以孢子和孢子體(根狀莖、匍匐莖、嫩葉)為外植體。國外對觀賞蕨類組織培養(yǎng)進(jìn)行了廣泛的研究,波士頓蕨(Nephrolepisexaltala‘Bostoniensis’)已經(jīng)成為第一個商業(yè)性快繁的觀葉植物(Hartmanetal.,1986)。中國對觀賞蕨類的組培研究近年才開始。以孢子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)即是在無菌培養(yǎng)條件下模擬自然環(huán)境中孢子發(fā)育的過程。在自然條件下蕨類植物通過葉腋及葉背產(chǎn)生的孢子進(jìn)行繁殖。孢子萌發(fā)是配子體世代開始的標(biāo)志,而判斷孢子萌發(fā)的標(biāo)志是初生假根或原葉體細(xì)胞的出現(xiàn)或者同時出現(xiàn),原葉體形態(tài)經(jīng)歷絲狀、片狀、心形等過程,在它的中部有一個較厚的伸長結(jié)構(gòu)分化形成頸卵器和精子器,在其下表面有假根。在有水的條件下頸卵器中的卵子和精子器中的精子受精形成合子,合子發(fā)育成胚,進(jìn)而形成幼小孢子體(邵莉楣,1994)。目前在蕨類植物中許多種類已利用孢子進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得成功,由于蕨類植物生活史與種子植物有很大差別,因此,在孢子培養(yǎng)過程中所需條件亦不盡相同(李文安和王玉琴,1990)。此外,孢子繁殖受很多因素影響:孢子的發(fā)育能力和儲存方式、培養(yǎng)基、土壤表面及孢子和土壤的滅菌、孢子的大小、播種密度及配子體和孢子體相互作用等(Fernández&Revilla,2003)。對于那些沒有孢子的種類,如波士頓蕨,則不能使用孢子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。以孢子體為外植體即通過將蕨類的根狀莖、嫩葉、匍匐莖、側(cè)枝、托葉、塊莖、根芽、鱗芽、莖尖等誘導(dǎo)為愈傷組織、不定芽、綠色球狀體(greenglobularbodies,GGB)進(jìn)行增殖,快速且取材不受季節(jié)限制。2加工過程模型采集的成熟孢子需先干燥1~2d,4℃低溫保存。接種的孢子需先在70%酒精中消毒幾秒,然后轉(zhuǎn)入升汞溶液或者次氯酸鈉中消毒2min,用無菌水漂洗幾次。為了消毒更徹底還可以使用表面活性劑,如吐溫。接種的孢子一般2~4周萌發(fā),但有些種類,如桫欏(Alsophilaspinulosa)、狼尾蕨(Davalliabullata)、鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)的孢子有休眠特性,可以用GA3預(yù)處理2~5min使之打破休眠(李文安和王玉琴,1990;程治英等,1991;Lietal.,2010)。3培訓(xùn)條件3.1原葉體的生長孢子萌發(fā)培養(yǎng)基一般采用MS為基本培養(yǎng)基。但有些種類在全培養(yǎng)基中不能萌發(fā),只有在稀釋的MS、Knudson、Knop等低鹽培養(yǎng)基中才能萌發(fā)。歐紫萁(Osmundaregalis)孢子在低氨濃度的培養(yǎng)基(Knop、Knudson或者1/4MS培養(yǎng)基)中生長最適(Fernándezetal.,1997a)。分枝莎草蕨(Schizaeadichotoma)孢子最高的萌發(fā)率(34%)也出現(xiàn)在1/4MS培養(yǎng)基中(Jasonetal.,2003)。紫萁(Osmundajaponica)孢子在1/8MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率可達(dá)95.3%,且萌發(fā)速度快(Higuchi&Amaki,1989)。鳳尾蕨(Pteriscretica)孢子培養(yǎng)在KP培養(yǎng)基上,其萌發(fā)時間、原葉體達(dá)到性成熟及孢子體開始產(chǎn)生的時間均早于在1/2MS培養(yǎng)基上。穗烏毛蕨(Blechnumspicant)配子體在MS液體培養(yǎng)基中生長最適(Fernándezetal.,1997b)。原葉體培養(yǎng)普遍采用半固化培養(yǎng)基,Douglas和Sheffield(1990)等采用液體培養(yǎng)基將原葉體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)獲得更好的增殖效果(Miller,1968)。孢子體培養(yǎng)大多采用MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的無機鹽濃度很重要,對于組培效率及試管苗的正常發(fā)育均有影響。Higuchi和Amaki(1989)報道1/4MS對腎蕨(Nephrolepiscordifolia)孢子體培養(yǎng)效果良好,而巢蕨(Aspleniumnidus)則以全量MS效果最佳。銀粉背蕨(Aleuritoptrisargentea)也以MS培養(yǎng)基最適于孢子萌發(fā)和原葉體生長,萌發(fā)率高達(dá)53.3%(黃笛等,2009)。Loescher(1979)的試驗也證明了MS培養(yǎng)基會對腎蕨屬孢子體培養(yǎng)過程中器官發(fā)生產(chǎn)生抑制,而稀釋MS培養(yǎng)基可以解除這種抑制。Dykeman和Cumming(1985)發(fā)現(xiàn),1/2MS對莢果蕨(Matteuaciastruthiopteris)的增殖最佳,而3/4MS對單個芽的生長最有利。張開梅等(2008)發(fā)現(xiàn),西南鳳尾蕨(Pteriswallichiana)在1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率可達(dá)83.3%。徐艷等(2005)也指出,白玉鳳尾蕨(Pteriscretica)在1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率可達(dá)82.3%。Thakur等(1998)發(fā)現(xiàn)將莢果蕨(Matteucciastruthiopteris)起源于假根分生組織的側(cè)根作為外植體,在含2.0mg·L-14-PU,0.5mg·L-1TDZ的1/2MS培養(yǎng)基中能獲得高速率的分生組織增殖。根原基在懸浮培養(yǎng)基中比在固體培養(yǎng)基快,假根的形成和再生物的生長在不含激素含0.4%瓊脂和1.1%活性炭的1/4MS固體培養(yǎng)基中達(dá)到最佳(Thakuretal.,1998)。由于直接從原葉體得到孢子體這一途徑的效率一般較低,Knauss(1976)發(fā)明了一種稱之為不完全組織培養(yǎng)技術(shù),將培養(yǎng)了2個月的原葉體與1/2MS液體培養(yǎng)基以1︰20比例于攪切器攪切成勻漿物加入固體MS培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)孢子體形成,能大大增加其增殖率。Fernández等(1999)將幾種的蕨類進(jìn)行機械性粉碎并將勻漿物進(jìn)行體外培養(yǎng),從孢子培養(yǎng)到孢子體發(fā)育的時間在不同種類中各有不同:對于有較快的生活史和孢子產(chǎn)量大的種類,如弗吉尼亞狗脊蕨(Woodwardiavirginica)、Dryopterisaffinis,將配子體勻漿是一種很有效的繁殖方法,能在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的孢子體,但是對于歐紫萁(O.regalis),將配子體進(jìn)行勻漿則抑制其孢子體的形成。此外還研究了培養(yǎng)基成分對歐紫萁(O.regalis)和劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)配子體發(fā)育的作用,在這些種類中,當(dāng)配子體培養(yǎng)于含水和0.7%瓊脂的培養(yǎng)基能促進(jìn)孢子體的形成,而加入蔗糖則抑制配子體的發(fā)育,還會導(dǎo)致壞死;不含蔗糖的1/2MS基本培養(yǎng)基有利于劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)孢子體葉的伸長(Fernándezetal.,1999)。Fernández等(1993)對巢蕨(Aspleniumnidus)孢子體和配子體分別進(jìn)行勻漿后測試其在含3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中的再生能力,2個月后,配子體勻漿再生出配子體,而孢子體勻漿則既形成孢子體又產(chǎn)生無孢子生殖的配子體。3.2葉瞳蕨pterisensi電泳的生長誘導(dǎo)外植體對芽生長的影響在原葉體生長發(fā)育階段加入細(xì)胞分裂素能促進(jìn)原葉體發(fā)育和孢子體形成。將莢果蕨(Matteucciastruthiopteris)的莖尖培養(yǎng)在含10-5和10-6mol·L-1細(xì)胞分裂素的半固體MS培養(yǎng)基中能誘導(dǎo)大量芽的形成(Gray&Partrick,1986)。Fernández等(1997b)發(fā)現(xiàn),在穗烏毛蕨(Blechnumspicant)的培養(yǎng)中,加入外源的GA3后孢子能萌發(fā),但配子體的發(fā)育受到強烈抑制,連二維生長都不能達(dá)到。孢子體可在無激素培養(yǎng)基中直接發(fā)育,但有些特殊蕨類按一般方法只能得到原葉體而無法誘導(dǎo)得到孢子體,如荷葉鐵線蕨(Adiantumreniformevar.sinense)需要在成熟原葉體上滴加1mg·mL-1ABA才能誘導(dǎo)形成孢子體(Loescher,1979)。在大葉黑桫欏孢子培養(yǎng)中,將原葉體轉(zhuǎn)入加有0.1mg·L-1NAA、0.1mg·L-16-BA和0.7%活性炭的MS培養(yǎng)基可長出綠色球狀體(greenglobularbodies,GGB),如果想得到大量繁殖材料,可在此培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng),短期內(nèi)可得到很大量綠色球狀體,再將球狀體誘導(dǎo)成孢子體(徐艷等,2004)。Fernández等(1996a,1996b)報道:將穗烏毛蕨(Blechnumspicant)和劍葉鳳尾蕨(PterisensiformisL.)幼嫩孢子體的假根培養(yǎng)在只含6-BA(0.44~4.4μmol·L-1)或者還含NAA(0.053~0.53μmol·L-1)的MS培養(yǎng)基中,1個月后能在假根的表面和內(nèi)部長出一些伸長中心。將這樣的假根培養(yǎng)于不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中1個月使內(nèi)部伸長組織進(jìn)行分化再生為大量的孢子體。再將該孢子體培養(yǎng)于上面提到的伸長培養(yǎng)基內(nèi),可誘導(dǎo)其表面的伸長中心產(chǎn)生配子體。此外,加入NAA的MS培養(yǎng)基可促進(jìn)穗烏毛蕨(Blechnumspicant)GGB的伸長,同時促進(jìn)穗烏毛蕨(Blechnumspicant)和劍葉鳳尾蕨(PterisensiformisL.)假根形成,以及劍葉鳳尾蕨(PterisensiformisL.)愈傷組織的形成。這種通過穗烏毛蕨(Blechnumspicant)假根形成GGB從而產(chǎn)生大量孢子體的方式,是對該種進(jìn)行大規(guī)模孢子體繁殖的有效途徑。Bertrand等(1999)也報道將Polypodiumcambricum的假根、葉片、葉柄和幼嫩孢子體根尖作外植體培養(yǎng)于含6-BA或NAA或兩者結(jié)合的培養(yǎng)基。GGB即使在不含調(diào)控因子的培養(yǎng)基中也能產(chǎn)生,加入BA后對于假根產(chǎn)生GGB十分有效。而根尖外植體表現(xiàn)出最低的器官形成能力。用BA預(yù)處理的勻漿葉片或假根進(jìn)行培養(yǎng)是該種蕨類植物繁殖的最有效途徑。在腎蕨屬(Nephrolepis)植物根狀莖尖培養(yǎng)中,誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生無需外源激素,但NAA、KT可以促進(jìn)芽的形成和增殖,而6-BA起抑制作用(Loescher,1979)。Beck和James(1983)對魚尾蕨(Nephrolepisfalcateformafurcans)的激素需求作了詳細(xì)的研究,確定了KT1~2mg·L-1+NAA0.01mg·L-1的組合有利于芽的增殖和叢生苗的形成。在莢果蕨(Matteucciastruthiopteris)根狀莖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),KT1~2mg·L-1對芽生長增殖效果佳,而NAA從對芽的生長增殖無促進(jìn)作用(Dykeman&Cumming,1985)。Harper(1976)在幾種蕨類植物組培中也發(fā)現(xiàn),最佳激素組合為KT和NAA,KT范圍1~2mg·L-1,NAA0.1~10mg·L-1;根的發(fā)生可被2,4-D、NAA等促進(jìn),但并非必需,根的發(fā)生在基本培養(yǎng)基中即可完成。在革葉蕨(Rumohraadiantiformis)組培中也發(fā)現(xiàn)6-BA對芽形成和增殖的抑制作用(Chen&Read,1983),但6-BA可以促進(jìn)蜈蚣草(Pterisvittata)、二歧鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)莖端葉片形成不定芽(Camlohetal.,1994)。此外,6-BA還可以改變組培苗的再生途徑,Higuchi等(1987)發(fā)現(xiàn)6-BA強烈抑制腎蕨屬完整試管苗的發(fā)生,但有利于GGB的形成和增殖,且通過GGB繁殖的速率比通過叢生芽階段繁殖的效率更高。后來GGB組培繁殖途徑在多種蕨類植物中應(yīng)用,如鳥巢蕨(Camloh,1999)、鹿角蕨(黃韶玲和張潔蓮,1993)、烏毛蕨(Fernándezetal.,1996a)、皺葉腎蕨(金建平和蘭濤,1992)、鳳尾蕨(Amaki&Higuchi,1992)等。Loescher(1979)認(rèn)為,低水平的2,4-D可以誘導(dǎo)波士頓蕨(Nephrolepisexaltalacv.Bostoniensis)生根,高濃度則促進(jìn)愈傷組織形成。Leffring和Soede(1982)指出在培養(yǎng)基中加入0.3~0.5mg·L-1IAA時,波士頓蕨試管苗誘導(dǎo)效果好。此外,2-ip、4-PU、TDZ、GA3、JA等也在莢果蕨(Matteucciastruthiopteris)、海金沙(Lygodiumjaponicum)等蕨類組培中應(yīng)用,并取得較好的增殖效果(Thakuretal.,1998;Nakamura&Maeda,1995;Camloh,1999)。精子器的發(fā)生與赤霉素有關(guān)。Yamane等(1979)運用多光譜測定發(fā)現(xiàn),GA9的甲酯可調(diào)控海金沙(Lygodiumjaponicum)生殖器官的形成。這種精子器形成調(diào)控系統(tǒng)在穗烏毛蕨(B.spicant)中也有報道:將含有成熟配子體的培養(yǎng)基提取物加入新培養(yǎng)基中進(jìn)行孢子培養(yǎng),孢子萌發(fā)后,它們能在配子體發(fā)育的任何階段發(fā)育成精子器,經(jīng)過分離純化這種培養(yǎng)基提取物,獲得了赤霉素。經(jīng)過HPLC分析還發(fā)現(xiàn)了一種非極性化合物,其存在時抑制配子體生長,但促進(jìn)精子器的形成,其缺乏時配子體增加,同時形成頸卵器(Fernández&Revilla,2003)。對于脆鐵線蕨(Adiantumtenerum),0.1~10mg·L-1的GA3降低原葉體長度和寬度,但促進(jìn)精子器形成,增加GA3到100mg·L-1則抑制孢子萌發(fā)(Kao&Yeh,2003)。Fernández等(1997b)等發(fā)現(xiàn),穗烏毛蕨(B.spicant)精子器形成的活性部分受游離和非極性的赤霉素酯影響,IBA為5和50μmol·L-1,6-BA為50μmol·L-1抑制精子器形成。多輪芳香烴(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)對蕨類生長發(fā)育也具有影響。有些報道指出PAHs促進(jìn)植物生長和形態(tài)建成。將多足蕨配子體培養(yǎng)在無菌且含PAHs的培養(yǎng)基內(nèi),PAHs劑量0.1~10.0mg·L-1,多足蕨配子體生長模式可以變化,并可以在細(xì)胞水平上觀察到形態(tài)建成;PAHs劑量0.1~3.2mg·L-1能促進(jìn)從一維結(jié)構(gòu)到二維結(jié)構(gòu)的形態(tài)形成。這種PAHs處理的植物,與未處理過的相比,低劑量(0.1~0.32mg·L-1)和高劑量(1.0~3.2mg·L-1)PAHs分別促進(jìn)和抑制細(xì)胞增殖,而10.0mg·L-1為有毒劑量,會降低孢子萌發(fā)和孢子體數(shù)(Forrestaetal.,1989)。3.3蔗糖對愈傷組織形成的影響對于營養(yǎng)物質(zhì)的需求取決于蕨類的品種。薄囊蕨類如巢蕨(Aspleniumnidus),穗烏毛蕨(Blechnumspicant),Dryopterisaffinis,劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)和弗吉尼亞狗脊蕨(Woodwardiavirginica),富營養(yǎng)元素的培養(yǎng)基,如全量MS培養(yǎng)基,能大大增加其干質(zhì)量,但歐紫萁(Osmundaregalis)則在Knop培養(yǎng)基中生長更好;氨加入Knop培養(yǎng)基中抑制歐紫萁(Osmundaregalis)配子體的生長,但對于劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)和穗烏毛蕨(Blechnumspicant)配子體生長卻是必需的;氨對于氮源異養(yǎng)種類如松葉蕨屬(Psilotum)和陰地蕨屬(Botrychium)的配子體生長來說是一種重要的氮源(Fernández&Revilla,2003)。蔗糖是體外培養(yǎng)中最廣泛使用的碳源。培養(yǎng)基中蔗糖濃度對孢子萌發(fā)有很重要的影響,如:桫欏的孢子隨著培養(yǎng)基中糖濃度的降低(0~2%),萌發(fā)所需時間縮短(程治英等,1991)。蔗糖對原葉體發(fā)育和孢子體形成有促進(jìn)作用(劉保東和檀龍顏,2009),在大多數(shù)蕨類中,配子體干質(zhì)量隨蔗糖濃度的增加而增加。然而歐紫萁(Osmundaregalis)的配子體在缺乏蔗糖的培養(yǎng)基中也能生長,說明存在植株的自養(yǎng)作用(Fernández&Revilla,2003)。而且據(jù)Fernández等(1997b)報道,在同樣的滲透壓下加入蔗糖和甘露醇,分別抑制和促進(jìn)穗烏毛蕨(Blechnumspicant)配子體的生長和發(fā)育。在將鳳尾蕨(Pteriscretica)分離葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)分化的試驗中,把幼嫩孢子體的葉片培養(yǎng)在加入2%蔗糖、1.0mg·L-12,4-D的White培養(yǎng)基中能誘導(dǎo)愈傷組織形成;獲得的愈傷組織可以在含蔗糖和高濃度生長素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)加入0.1g·L-1或更高濃度的蔗糖、葡萄糖或果糖時,愈傷組織形成孢子體,配子體形成也有發(fā)現(xiàn);而不提供外源糖時,沒有孢子體形成,愈傷組織只分化成配子體,而且這種作用不受0.01mg·L-12,4-D的影響(Bristow,1962)。Harper(1976)指出,MS培養(yǎng)基中添加P元素,稱為MFMM培養(yǎng)基,廣泛用于蕨類尤其是腎蕨屬的組織培養(yǎng)中。Paek等(1984)也證明,MS+NaH2PO4200mg·L-1有利于腎蕨叢生苗的發(fā)生。Borgen和Nass(1987)認(rèn)為培養(yǎng)基中添加磷酸鈉鹽有助于波士頓蕨的增殖。3.4配子體的生長和光反應(yīng)絕大多數(shù)蕨類的孢子需要暴露于光下才能萌發(fā)和生長(吳華等,2010),但某些種類,如:陰地蕨屬(Botrychium)和瓶兒小草屬(Ophioglossum),則需要在黑暗中萌發(fā)(Fernández&Revilla,2003)。光還控制配子體的發(fā)育,光照是大多數(shù)蕨類配子體二維生長必需的(張銀麗等,2009),但歐紫萁(Osmundaregalis)配子體卻是在暗中出現(xiàn)二維生長和性器官的形成(Fernándezetal.,1997a),巢蕨(Aspleniumnidus)的配子體也是在較弱的光強下生長更好(Fernández&Revilla,2003)。當(dāng)蜈蚣草(Pterisvittata)的孢子萌發(fā)后加入礦物鹽并移到暗中直接由孢子發(fā)育為雄性孢子囊,這種雄性器官的發(fā)生受紅光和藍(lán)光抑制,這個光反應(yīng)過程需要Ca2+和NO3-離子(Gemmrich,1986;Ito,1988)。Ito(1974)報道,將蜈蚣草(Pterisvittata)的單細(xì)胞原葉體置于連續(xù)紅光下,就會持續(xù)在細(xì)胞分裂間期的G1期,如果在黑暗之后用藍(lán)光照射能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂;藍(lán)光的作用能被之后的紅光逆轉(zhuǎn),紅光之后又要經(jīng)過一個較長時間的藍(lán)光才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂;在藍(lán)光之后照射紅光或移入黑暗中,細(xì)胞就從G1早期同步進(jìn)入接下來的細(xì)胞周期而進(jìn)入有絲分裂;在有絲分裂周期內(nèi)無論是紅光還是藍(lán)光對誘導(dǎo)下一個細(xì)胞周期的進(jìn)入都沒有任何效果;因此可以通過1h的藍(lán)光和15h的紅光獲得高同步性的細(xì)胞分裂。光利于苗的發(fā)生。Loescher(1979)等在腎蕨屬植物組培中發(fā)現(xiàn),光對不定芽的誘導(dǎo)是必需的,不能為外源激素和碳源替代。3.5溫度對0.28.7的影響適宜蕨類孢子萌發(fā)和配子體生長發(fā)育的適宜溫度為15~24℃,pH5.4~6.0(曾漢元和丁炳揚,2004)。腎蕨(Nephrolepiscordifolia)在27℃生長最好(Hvoslef-Eide,1991)。巢蕨(Aspleniumnidus)和穗烏毛蕨(Blechnumspicant)對pH4.2~8.7間變化有很大的耐受力(Fernándezetal.,1993,1997b)。歐紫萁(Osmundaregalis)在pH5.7時生長最適(Fernándezetal.,1997a)。Pangua等(1994)研究了鐵角蕨屬(Asplenium)3個種的孢子萌發(fā)和性器官發(fā)育對溫度的要求;鐵角蕨(A.trichomanes),厚葉鐵腳蕨(A.scolopendrium)在10℃時所有孢子都能萌發(fā),卵葉鐵角蕨(A.ruta-muraria)在低于15~25℃時萌發(fā)延遲或受抑制。在10℃時,鐵角蕨(A.trichomanes),厚葉鐵腳蕨(A.scolopendrium)產(chǎn)生雌雄配子體和雌雄同體配子體,而卵葉鐵角蕨(A.ruta-muraria)只產(chǎn)生雄配子體和雌雄同體配子體(Panguaetal.,1994)。4培養(yǎng)基的免疫作用蕨類植物除進(jìn)行正常的世代交替過程外,在環(huán)境條件發(fā)生變化時,如營養(yǎng)不良、受損等情況下,能通過捷徑來加速完成其生活史,即無配子生殖和無孢子生殖。孢子體由有性和無性配子體的分生組織發(fā)育而成或直接起源于原葉體細(xì)胞,不需經(jīng)過授精過程,即孢子體屬于無配子生殖(陸樹剛,2007)。而無孢子生殖是孢子體直接衍生出配子體,經(jīng)過配子融合形成多倍的孢子體。在自然條件下,世代轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率極低,而在組織培養(yǎng)條件下,可以大大促成配子體世代和孢子體世代的直接轉(zhuǎn)換。在培養(yǎng)基中對世代轉(zhuǎn)換調(diào)控起重要作用的是糖。一般認(rèn)為高糖有利于無配子生殖,而低糖則促進(jìn)無孢子生殖。Ambro?i?-Dolin?ek等(2002)對二歧鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)幼葉無孢子生殖產(chǎn)生的配子體進(jìn)行誘導(dǎo),將葉片外植體培養(yǎng)在含0、0.01%、0.1%、1%和2%蔗糖的MS培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn),較低的蔗糖濃度(0.01%)和葉片近軸的傷口能促進(jìn)無孢子繁殖產(chǎn)生配子體(90%的葉片產(chǎn)生配子體),細(xì)胞懸浮計數(shù)分析表明,孢子體和無孢子生殖產(chǎn)生的配子體的染色體倍數(shù)相同。MS培養(yǎng)基加入Difco-agar、糖醇(山梨糖醇、甘露醇)、生長調(diào)節(jié)劑(NAA、2,4-D、6-BA、細(xì)胞分裂素)和糖(果糖、葡萄糖、蔗糖),在低濃度時誘導(dǎo)蜈蚣草(Pterisvittata)葉片無孢子生殖,而在高濃度時同時產(chǎn)生無孢子配子體和愈傷組織,愈傷組織在沒有生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中再生為孢子體,配子體在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無性繁殖,但轉(zhuǎn)移到1/10MS培養(yǎng)基中產(chǎn)生孢子體(Kwaetal.,1991)。糖在培養(yǎng)基中所起作用主要是營養(yǎng)而非滲透壓作用(Hirsh,1975;Kwaetal.,1991),而糖醇是通過滲透壓的調(diào)節(jié)對世代轉(zhuǎn)換產(chǎn)生影響。低濃度糖醇有利于無孢子生殖的誘導(dǎo)(Kwaetal.,1991)。培養(yǎng)基中某些成分的變化,如將檸檬酸鐵改為Fe-EDTA,有機N濃度的變化,高壓滅菌與過濾滅菌對無配子生殖的誘發(fā)并無影響,而在原葉體培養(yǎng)中通過定期更換新鮮培養(yǎng)基,可以促進(jìn)無配子生殖的發(fā)生(Whittier,1964)。在培養(yǎng)基中加入IAA可以誘發(fā)無配子生殖,而NAA、6-BA、2,4-D、KT在低濃度0.1~1mg·L-1時均有利于無孢子生殖的誘導(dǎo)(Kwaetal