實驗二十六動物細胞融合實驗目的了解動物細胞融合的常用方法。學習化學融合的基本操作過程及其應用。觀察動物細胞融合過程中細胞的行為和變化。實驗原理細胞融合:指在培養(yǎng)或誘導條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的過程；又叫細胞雜交，分為同核和異核。成功的標志為：融合后的細胞能正常分裂、生長。動物細胞融合的方法：病毒誘導融合：利用仙臺病毒等被膜中含有融合蛋白的病毒，通過改變動物細胞細胞膜的脂雙層促使動物細胞融合。化學誘導融合：利用化學試劑如聚乙二醇（PEG），利用相似相溶的原理，改變細胞膜脂質分子的排列，在去除這些物質之后，細胞膜趨向于恢復原有的有序結構。在恢復過程中相接觸的細胞由于接口處脂質雙分子層的相互親和與表面張力，細胞融合，胞質流通，發(fā)生融合。融合過程：細胞接觸一一膜融合一一形成啞鈴型細胞。化學誘導融合方法，操作方便，融合效率高。附：PEG的分子量：400-6000道爾頓，其中科研時采用800-1000道爾頓。PEG的濃度：40%-60%作用時間：1分鐘（科研）PH：8.0-8.2溫度：38-40°C電激誘導融合：基于顯微鏡下的細胞融合，其中電誘導（激光誘導）是先使細胞在電場中極化成為電偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖（激光）擊破細胞膜，細胞膜的脂質分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細胞發(fā)生融合。電激誘導融合方法具有無毒高效的優(yōu)點。本次實驗選用化學誘導融合方法。實驗用品材料：雞血紅細胞。試劑：0.85%氯化鈉溶液，GKN溶液（磷酸緩沖液），Alsever’s細胞保存液，50%PEG。器材：顯微鏡、離心機、離心管、載玻片、蓋玻片。實驗步驟取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液。（可在4C保存）往離心管中取①1ml+4ml0.85%的NaCl溶液，進行一次1000r/min、5min離心取出離心管，抽出上清液，加入GKN液4ml使細胞濃度適宜，采用吹氣泡等方法混勻，制成懸液。取出三個離心管：第一個加入1ml，第二個加入0.5ml，第三個加入0.5ml上述懸液。在第一個管中加入0.5mlPEG溶液，接觸30-40s時混勻；在第二個管采取上述相同操作；在第三個管中加入1mlPEG溶液，接觸少于30s后混勻；靜置2-3min。分別取上述溶液制成裝片，在顯微鏡下觀察并記錄三個條件下的融合情況以及融合過程。實驗完畢后，清洗實驗器材并置于原處。實驗結果

接觸融合融合后1ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1mlPEG接觸融合融合后1ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1mlPEG由實驗結果可得隨著PEG的濃度的增加，細胞的融合率不斷增加;同時細胞變形所需的時間越短.故而，在科研過程中PEG作用的時間應維持在1min左右.同時細胞濃度越小，融合率越高.分析與討論在觀測過程中發(fā)現(xiàn)有細胞堆積的現(xiàn)象,不易于觀察,因此在實驗過過程中，應注意控制細胞濃度,且在兩次混勻時要注意徹底混勻.1ml(0.5ml)細胞溶液+0.5mlPEG條件下，應注意在兩者接觸30-40S時在混勻,如此實驗結果會更明顯，但在0.5ml細胞溶液+1mlPEG條件下，接觸時間應少于30s.以免細胞變形.在實驗過程中，應在作用2-3min后在觀察，但時間不應太久,否則細胞變形將影響觀察.在觀察中應將光圈調小，如此實驗結果將更明顯.在觀察過程中應仔細耐心,注意區(qū)分重疊和接觸的不同.動物細胞融合的應用動物細胞融合是從細胞水平來改變動物細胞的遺傳性，用于生產單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品，改良培育動物新品種，縮短動物的育種過程。動物細胞融合的應用范圍已廣及生物學的各個分支學科，特別是在繪制人類基因圖譜方面取得了顯著成績。雖然細胞雜交屬于理論生物學范疇，但在實際應用方面也有重大突破。在基礎理論研究上，動物細胞融合技術對研究細胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機制等方面都有重要意義。在實際應用方面，動物細胞融合技術在藥物定向釋放系統(tǒng)、細胞治療以及抗腫瘤免疫等方面起到重要的作用。動物體細胞雜交技術主要應用于以下幾個方面。一、 用于基因定位和繪制人類基因圖譜JP2雜種細胞中某一染色體或其片段的存在與否與細胞的某一性狀表達與否相聯(lián)系，從而可以實現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細胞中，人的染色體優(yōu)先丟失，并證明利用這一特點有可能對人染色體上的基因進行定位。1970年Ruddle等開始系統(tǒng)地用融合細胞作為實驗系統(tǒng)來繪制人類基因圖。二、 用于生產樹突狀細胞抗腫瘤疫苗一般認為腫瘤細胞表面抗原不能誘導強的免疫應答反應，樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)與腫瘤細胞融合形成的樹突狀細胞疫苗能夠有效地激發(fā)機體的細胞免疫應答，無論是在動物研究還是在人體早期臨床試驗中都證明這是一種方便、安全、可行的方法。并且由于融合細胞可以在體內存活，因此可以維持較長時期的免疫應答，有利于誘發(fā)機體產生有效的抗腫瘤免疫。腫瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式與DCs結合，或者將腫瘤抗原基因轉化進DCs中，使其內源性地表達抗原，這兩種方法在抗腫瘤免疫應答中均有效，但適于免疫的腫瘤抗原及其基因難以鑒定從而限制了其應用，有實驗證明用這兩種方法制備的腫瘤疫苗的免疫原性不及腫瘤細胞與樹突狀細胞直接融合的異核細胞，融合細胞保持了DCs和腫瘤細胞的特性，并且能高效地將未知的腫瘤抗原提呈給免疫系統(tǒng).三、 用于生產單克隆抗體使小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合形成能產生單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）的雜交瘤細胞，單克隆抗體具有專一性和靈敏性，作為理論研究的工具在病原檢測和疾病治療以及食品安全領域具有廣闊的應用前景。目前有關單位利用McAb作用的專一性這一特點正在探索用“生物導彈”對癌癥進行早期診斷和治療。四、 用于動物育種體細胞核移植技術（somaticcellnucleartransfertechnique,SCNT）是將細胞核移植到另一細胞的細胞質中的生物技術。動物體細胞融合后，雜種細胞難以發(fā)育再生為一個個體，但借助于細胞核移植的方法將融合后雜種細胞的細胞核移入去核成熟卵內，可培育新的雜種。另外，細胞核移植技術的建立，還為目前進行的哺乳動物體細胞克隆和轉基因技術打下良好的實驗基礎。五、 用于細胞療法SCNT將患者的任何體細胞與去核卵細胞融合，融合子進行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內細胞團是多能干細胞，對多能干細胞進行誘導使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來源問題，并且也避免了宿主對外來物的免疫排斥。六、 動物體細胞融合在基礎理論研究方面的應用（1）用于研究細胞的核質關系和個體發(fā)育。20世紀70年代初，誕生了細胞拆合工程。Carter于1967年發(fā)現(xiàn)細胞松弛素B（CB）能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠L細胞的排核作用。Prescott等1972年首先應用離心術結合CB分離哺乳類細胞的胞質體獲得成功，為研究哺乳類細胞的核、質相互關系、細胞質基因的轉移開創(chuàng)了新的途徑。異核體和細胞雜合子被用來確定基因調節(jié)因子，這些調節(jié)因子決定一個細胞表型消失或得以保持以及賦予受體新性狀；通過對供體和受體細胞所有細胞特異性基因表達研究，細胞融合有助于人們了解發(fā)育，特別是在研究基因編碼的可逆性方面。在個體發(fā)育過程中，血紅蛋白存在著從胚胎型向胎兒型（幼蟲）最終向成人型的轉換，對這些轉換進行研究，除了揭示基因順序表達的調控機理外，在醫(yī)學方面也有意義，人們可以部分或全部扭轉從胚胎型向胎兒型的轉變從而治療鐮刀型貧血病。（2） 用于揭示疾病發(fā)生的機制。與其他技術結合使用，細胞融合是一種揭示疾病機理的有效方法。例如，細胞融合與免疫熒光，生化分析，電鏡技術相結合，LattanziG等對肌肉萎縮癥發(fā)生的機理進行了研究。（3） 用于膜蛋白動力學研究