綠木霉對水稻紋枯病菌的拮抗作用及機(jī)理

0抗病品種的應(yīng)用[研究意義]水稻陰道腐敗和水稻栽培是三種水稻疾病中的兩種。水稻紋枯病是由立枯絲核菌[Rhizoctoniasolani,teleomorph:Thanatephoruscucumeris(Frank)Donk)]引起的。該菌產(chǎn)生的菌核結(jié)構(gòu)具有抗逆性、忍耐極端環(huán)境條件的能力,這些特性使其在病原菌的存活和傳播中起著關(guān)鍵作用,也使該病害成為生產(chǎn)上最難防治的病害之一。而稻瘟病病原菌小種復(fù)雜多變,難以獲得對多種病原小種都有廣普抗性的水稻品系,生產(chǎn)上仍然以藥劑防治為主。近年來,由于雜交水稻和秈粳交育成的高產(chǎn)品種的推廣以及氮肥用量不斷加大,稻曲病的發(fā)生日趨嚴(yán)重,已從次要病害上升為主要病害,而針對該病害的抗病育種工作尚未開展。利用抗病品種防治水稻病害被公認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的措施,也是防治三種重要病害最直接的途徑。由于水稻抗病育種尚未取得突破性進(jìn)展,水稻真菌病害主要是采用藥劑防治和農(nóng)業(yè)栽培防治相結(jié)合的綜合防治方法。但長期使用藥劑,容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性,還會因長期大量使用農(nóng)藥造成自然生態(tài)環(huán)境污染及稻米的農(nóng)藥殘留問題。近年來,轉(zhuǎn)基因抗病育種工程已培育出同時抗稻瘟病和紋枯病的水稻新品系,但人們對轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險性的擔(dān)憂,使得這些品系迄今還未在生產(chǎn)上廣泛使用。井崗霉素是水稻紋枯病的主要防治藥劑,但是已經(jīng)使用了20多年,防治紋枯病的用藥量不斷提高,現(xiàn)每年使用次數(shù)已經(jīng)從20年前的2次增加到目前的3—4次,使用量也已從1.5kg·hm-2增加到目前的4.5—6.0kg·hm-2。一旦井岡霉素防治失效,水稻生產(chǎn)將面臨巨大的風(fēng)險,急需有效的新產(chǎn)品替代?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】一些研究表明,木霉菌防治水稻紋枯病具有良好的防治效果,這為防治水稻病害開辟了另外的途徑。筆者針對抑制菌核形成篩選出了綠木霉(Trichodermavirens)菌株TY009,通過對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)分析,其有效生物活性成份被鑒定為膠霉毒素(gliotoxin)(將另文介紹)。同時,該菌株已被EGFP標(biāo)記,利用其轉(zhuǎn)化子對定殖菌核的機(jī)制也進(jìn)行了深入研究?！颈狙芯壳腥朦c】由于該菌株對立枯絲核菌的拮抗作用和應(yīng)用生防的潛力還沒有被評價;再者,膠霉毒素是一種廣譜性抗菌素,對多數(shù)植物病原真菌有抑制作用,但還未見對稻瘟病菌和稻曲病菌抑制作用的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文主要研究綠木霉菌株TY009對立枯絲核菌的拮抗作用,以及其代謝產(chǎn)物膠霉毒素對立枯絲核菌菌絲生長和菌核萌發(fā)、稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成、稻曲病菌分生孢子萌發(fā)和次生孢子形成的抑制作用和對其穩(wěn)定性進(jìn)行評價。旨在闡明TY009菌株防治水稻紋枯病、稻瘟病和稻曲病的應(yīng)用潛力。1材料和方法1.1抗菌、微生物和培養(yǎng)基綠木霉菌株(Trichodermavirens)TY009、棘孢木霉(T.asperellum)TG、哈茨木霉(T.harzionum)TC3、哈茨木霉(T.harzionum)NF9(由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所植物真菌病害與生物防治實驗室分離鑒定)保存在-20℃(孢子+17%脫脂奶粉+3g硅膠顆粒)。立枯絲核菌(RhizoctoniasalaniAG1-IA)HZ001(分離自中國水稻研究所試驗田間)保存在-70℃(菌片在20%甘油中)。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)Guy-11和稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)SXⅡ保存在斜面試管中。4個木霉菌株在PDA平板上活化,在黑暗25℃條件下培養(yǎng)。稻瘟病菌(M.oryzae)Guy-11的活化和培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(completemedium,CM)上進(jìn)行。稻曲病菌(U.virens)SX11的活化和培養(yǎng)在PSA(potatosucroseagar)培養(yǎng)基上進(jìn)行。稻瘟病菌和稻曲病菌產(chǎn)孢在25℃光照交替條件下進(jìn)行。1.2分離、蒸干、純化綠木霉菌株TY009在25°C、PDA平板上培養(yǎng)產(chǎn)孢后,1.0mL制備的孢子懸浮液(1×106)接種到含2LPDB(馬鈴薯葡萄糖汁)液體培養(yǎng)基(含有0.1%幾丁質(zhì))的震蕩燒瓶(4L)中。在25°C搖床(125r/min)上進(jìn)行培養(yǎng)。每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)10d后,過濾培養(yǎng)液的有機(jī)相用分離漏斗分離、蒸干(RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀),平均每個處理獲得粗提物約0.3874g。合并后的粗提物通過柱層析[流動性為石油醚﹕乙酸乙酯(v﹕v)=2﹕8]分離,再用制備型硅膠板(GF254,0.5mm)對含有膠霉毒素的組份進(jìn)行純化,共獲得純化產(chǎn)物37.53mg。最后在半制備液相色譜儀[aWaters600Pre-HPLC,具有Shim-packPrepODS柱(20×2cm,I.D,10μm),USA]上進(jìn)行純化,蒸干后獲得膠霉毒素純產(chǎn)物為34.11mg。用分析型液相色譜儀[Agilent1100HPLC,ZorbaxSBC18(250×4.6mm,I.D,5μm),USA]分析結(jié)果表明,產(chǎn)物純度為98.26%,該產(chǎn)物用于其后的活性測定。1.3培養(yǎng)水稻紋枯病菌株選用生防菌株TC3、NF9和TG為對照,試驗采用Melo等所采用的對峙培養(yǎng)方法,即先將預(yù)先活化的水稻紋枯病菌HZ001的菌片(5mm)接種于直徑90mm的PDA培養(yǎng)皿中,菌塊邊緣距離皿的邊緣10mm。培養(yǎng)24h后,分別接種預(yù)先活化的木霉菌株TY009、TC3、NF9和TG菌片于水稻紋枯病菌株HZ001菌片的對面,相距60mm。培養(yǎng)皿放置在26℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3d后進(jìn)行觀察記錄。為了評價對立枯絲核菌的拮抗程度,采用Bell等1—5級分級標(biāo)準(zhǔn):1級(木霉菌完全長過立枯絲核菌,并覆蓋整個培養(yǎng)皿);2級(木霉菌長過全皿的2/3以上);3級(木霉菌占1/2以上,<2/3);4級(紋枯病菌占全皿2/3以上);5級(紋枯病菌長過木霉菌,并覆蓋全皿)。1.4水稻紋枯病菌的dmso處理為了觀察綠木霉菌株TY009對水稻紋枯病菌菌絲的抑制作用,試驗采用Almassi等和Vinale等抑菌方法,即用二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)溶解上述制備的膠霉毒素,并用無菌水配制成5.0mg·mL-1母液,再稀釋成系列濃度的溶液;從活化的水稻紋枯病菌菌落邊沿打取菌片0.5cm接種于直徑90mm的PDA平皿中心(菌面向上),然后吸取10μL膠霉毒素系列溶液,均勻涂布菌片上。每個濃度處理重復(fù)3次。用相同濃度的DMSO溶液為對照。處理放置在25℃黑暗條件下培養(yǎng),不同時間觀察和記錄菌絲生長情況。用DMSO溶解膠霉毒素,并用無菌水配制成系列濃度的溶液,每個處理放入20枚均勻一致的水稻紋枯病菌菌核(產(chǎn)生于培養(yǎng)10d的PDA上)。以相同濃度的二甲基亞砜的水溶液為對照,每個濃度處理重復(fù)3次。先用手振動使每個處理中的菌核沉入水中,再放入搖床(80r/min)振蕩處理4h。分別取出不同處理后的菌核,用無菌水沖洗3次,并用濾紙(無菌)吸去多余水分,置PDA培養(yǎng)基上,在25℃、黑暗下培養(yǎng)24h后觀察和記錄核萌發(fā)狀況。1.5分生孢子萌發(fā)和培養(yǎng)用無菌水洗下CM培養(yǎng)基上的稻瘟病菌孢子,制備成孢子懸浮液(2×106孢子/mL)。用上述配制成的膠霉毒素母液(5mg·mL-1)與孢子懸浮液一起配制成系列濃度的孢子溶液。最終每個處理中的孢子濃度為1×106孢子/mL,每個處理中膠霉毒素的含量分別為1.0、10.0、50.0、100.0、150.0和200.0μg·mL-1。以無菌水配制的和含2%的DMSO(濃度相同于最大處理中膠霉毒素含量)孢子懸浮液為對照,每個處理重復(fù)3次。吸取0.5mL孢子懸浮液滴加在在聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿中,置培養(yǎng)皿于保濕容器中,在25℃黑暗條件下培養(yǎng)48h后,顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)和附著胞狀況。每個處理觀察200個孢子,記錄、統(tǒng)計生孢子萌發(fā)和附著胞形成數(shù)量。1.6高毒質(zhì)體懸浮液的配制從PSA培養(yǎng)基上挑取稻曲病菌孢子,配制成孢子懸浮液(2×106孢子/mL)。用上述配制成的膠霉毒素母液(5mg·mL-1)與孢子懸浮液一起配制成系列濃度的孢子溶液。最終每個處理中的孢子濃度為1×106孢子/mL,每個處理中膠霉毒素含量分別為1.0、10.0、50.0、100.0、150.0和200.0μg·mL-1。以無菌水配制的和含2%DMSO(濃度相同于最大膠霉毒素含量)的孢子懸浮液為對照,每個處理重復(fù)3次。加0.5mL孢子懸浮液于培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)條件同上。24h后,在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)和次生孢子產(chǎn)生狀況。1.7pda平板的制備用DMSO溶解膠霉毒素,稀釋成濃度相同的等份溶液(50mg·mL-1),分別置于100℃水浴條件下處理10、20、30、40、50和60min。處理后的溶液分別與融化的PDA(45℃左右)配制成PDA平板,平板中含膠霉毒素濃度為40和80μg·mL-1。在培養(yǎng)基中心接上水稻紋枯病菌HZ001菌片,未經(jīng)處理的溶液(無膠霉毒素,但含相同濃度的DMSO)作為對照,每個處理重復(fù)3次。放置培養(yǎng)皿于培養(yǎng)箱中,在26℃黑暗條件下培養(yǎng)2d,觀察菌落生長情況。1.8不同ph的分散液對dmso的培養(yǎng)用PSA培養(yǎng)基上的稻曲病菌孢子,配制成孢子懸浮液(2×106孢子/mL)。用上述配制成的膠霉毒素母液(5mg·mL-1)與稻曲病菌孢子懸浮液一起配制成1×106孢子/mL的孢子懸浮液。用0.5mol·L-1的NaOH和5%的HCL調(diào)節(jié)pH值,使不同處理的孢子懸浮液pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0。不同處理中的DMSO的濃度相同(2%),以無菌水配制的以及含2%DMSO的不同pH處理(1.0—12.0)的孢子懸浮液為對照,每個處理重復(fù)3次。加0.5mL孢子懸浮液于培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)24h后,在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)和次生孢子產(chǎn)生狀況。2結(jié)果2.1對水稻紋枯病菌的抗性特征所有測試的木霉菌株都能抑制水稻紋枯病菌的生長,并表現(xiàn)較強的拮抗作用,拮抗級別都達(dá)到1級(Bell等采用的分級標(biāo)準(zhǔn))。統(tǒng)計分析結(jié)果,木霉菌株NF9顯示更高程度的拮抗作用,控制了水稻紋枯病菌65%的生長,與菌株TC3和TY009沒有顯著差異(P=0.05)(表1)。這表明木霉菌株TY009對水稻紋枯病菌具有顯著的拮抗作用。然而,菌株TY009的產(chǎn)孢量明顯少于其它3個木霉菌株,木霉菌株NF9、TC3和TG都能在PAD培養(yǎng)皿中產(chǎn)生大量的綠色分生孢子(圖1)。2.2膠霉毒素對水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)的影響膠霉毒素對水稻紋枯病菌菌絲的生長有顯著的抑制作用,并隨濃度的增加而增強(表2)。2d后測定結(jié)果表明,膠霉毒素在濃度1μg·mL-1時對菌落生長沒有抑制作用。2%DMSO對菌絲生長也無抑制作用。然而,當(dāng)隨著膠霉毒素濃度增加,抑制菌絲的生長也越顯著,當(dāng)濃度達(dá)到150μg·mL-1時,完全抑制了菌絲的生長。膠霉毒素對水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)有顯著的抑制作用,但在一定的濃度范圍內(nèi)菌核具有耐受膠霉毒素的能力(表2)。24h后觀察結(jié)果表明,膠霉毒素濃度在5.0—20μg·mL-1范圍內(nèi),對菌核萌發(fā)沒有抑制作用。2%DMSO對菌核萌發(fā)也無抑制作用。但膠霉毒素濃度在40.0—80.0μg·mL-1范圍內(nèi),顯著地抑制菌核萌發(fā),但兩濃度間差異不顯著(P=0.05和P=0.01)。然而,當(dāng)膠霉毒素濃度達(dá)到160μg·mL-1時,完全抑制了菌核萌發(fā)。膠霉毒素濃度在一定的濃度范圍內(nèi),不同處理的菌核萌發(fā)率間沒有顯著差異,不同于膠霉毒素對菌絲的抑制作用。2.3藥物相互作用對生全指標(biāo)的影響膠霉毒素對稻瘟病菌孢子的萌發(fā)和附著孢形成都有顯著的抑制作用(表3)。膠霉毒素在濃度1μg·mL-1時,對孢子萌發(fā)率沒有明顯的影響,2%DMSO對孢子萌發(fā)沒有顯著的抑制作用。然而在此濃度下,卻對附著孢形成有顯著的抑制作用(P=0.01)。在濃度10—50μg·mL-1范圍內(nèi),膠霉毒素顯著地抑制了孢子的萌發(fā),不同濃度間孢子萌發(fā)率無顯著差異。同樣,在此濃度下,膠霉毒素完全抑制了附著胞的形成。這些結(jié)果表明,附著孢形成比孢子萌發(fā)對膠霉毒素更敏感。當(dāng)濃度達(dá)到50μg·mL-1時,膠霉毒素完全抑制了孢子的萌發(fā)。膠霉毒素對稻曲病孢子的萌發(fā)具有更顯著的抑制作用(表3)。當(dāng)濃度為1.0μg·mL-1時,膠霉毒素對稻曲病孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用(P=0.01),但對次生孢子的形成沒有顯著的抑制作用(P=0.01)。這表明,2%DMSO對孢子萌發(fā)和次生孢子形成沒有顯著的抑制作用,孢子萌發(fā)和次生孢子形成過程中對膠霉毒素的敏感性也沒有顯著差異。而當(dāng)濃度達(dá)到10μg·mL-1時,膠霉毒素完全抑制了孢子萌發(fā)和次生孢子的形成。比較稻曲病菌和稻瘟病菌孢子萌發(fā)對膠霉毒素的敏感性,孢子萌發(fā)率的結(jié)果表明,稻曲病菌孢子比稻瘟病菌對膠霉毒素更敏感。在相同濃度的膠霉毒素溶液中,稻曲病菌的萌發(fā)率、次生孢子形成率和稻瘟病菌的萌發(fā)率、附著胞形成率明顯不同,這反映不同病原菌之間以及同一病原菌在不同發(fā)育階段對膠霉毒素的敏感程度是不同的。2.4菌落生長和對溫度的影響在相同溫度和不同時間處理后測定膠霉毒素對水稻紋枯病菌菌絲生長的結(jié)果表明,在100℃下加熱10、20、30、40、50和60min后,在含40μg·mL-1的膠霉毒素平板上,菌落生長2d后的直徑分別為(3.1±0.4)、(2.8±0.2)、(2.9±0.4)、(2.9±0.2)、(3.2±0.3)和(3.0±0.3)cm,處理和對照之間的菌落直徑?jīng)]有顯著差異(P=0.01)。同樣,相同溫度和不同時間處理后,在含80μg·mL-1的膠霉毒素平板上培養(yǎng)2d,菌落生長完全被抑制,與對照完全一致。這表明膠霉毒素對水稻紋枯病菌的生物活性沒有隨著高溫處理而改變。然而,處理前膠霉毒素的溶液近無色或略帶淺黃色,但隨著加熱時間的增加,膠霉毒素溶液逐漸加深,直到變成淡褐色。2.5不同ph對稻曲病菌分生孢子萌發(fā)的影響稻曲病菌的分生孢子能在pH2.0—10.0的水溶液中萌發(fā),萌發(fā)率呈正態(tài)分布,pH5.0萌發(fā)率達(dá)到最大,但在pH4.0和6.0之間沒有顯著差異(P=0.01)(圖1)。與對照相比,在含0.5μg·mL-1膠霉毒素的不同pH溶液中,稻曲病菌的分生孢子萌發(fā)在pH4.0—10.0之間,萌發(fā)率也呈正態(tài)分布,pH小于4完全抑制孢子萌發(fā),pH<7抑制孢子萌發(fā)活性與對照差異顯著,但pH>7與對照沒有顯著差異。稻曲病菌次生孢子也能形成在pH2.0—10.0之間的水溶液中,但次生孢子形成率在不同pH間差異不顯著(P=0.01)。與對照相比,在含0.5μg·mL-1膠霉毒素的不同pH溶液中,pH<4次生孢子形成率與對照差異顯著,但pH>3.0與對照差異不顯著(圖2)。膠霉毒素抑制稻曲病菌孢子萌發(fā)和次生孢子形成的結(jié)果都表明,pH值顯著影響膠霉毒素生物活性,膠霉毒素在酸性條件下生物活性顯著。3膠霉毒素對水稻紋枯病菌的生物活性木霉菌(Trichodermaspp.)對植物病原菌有多種拮抗作用機(jī)制,包括競爭作用、重寄生作用、溶菌作用及產(chǎn)生抗菌素類物質(zhì),其中2種或3種機(jī)制可協(xié)同相互增強了對病原菌的拮抗作用。木霉菌擁有防治植物病原菌的特性,使其在世界范圍被成功地用作生防制劑?，F(xiàn)已知道許多木霉種類能產(chǎn)生具有抗菌素活性的次生代謝物,大量的抗菌化合物已被鑒定。由于不同的木霉菌對植物病原菌具有不同的拮抗機(jī)制,產(chǎn)生抗菌化合物種類差異很大,獲得具有多種拮抗機(jī)制的木霉菌株并用于生防制劑,一直是生物防治研究的重要內(nèi)容。筆者利用篩選出的綠木霉菌株TY009,已研究了該菌株對水稻紋枯病菌的作用機(jī)制。本文主要報道了產(chǎn)膠霉毒素菌株TY009對水稻紋枯病菌的拮抗效果,它的活性代謝物膠霉毒素對水稻紋枯病菌菌絲生長和菌核萌發(fā)的抑制作用,以及膠霉毒素對熱和pH的穩(wěn)定性。本文及已有的研究結(jié)果都闡明了該菌株應(yīng)用于防治水稻紋枯病的潛力。在此基礎(chǔ)上,筆者還進(jìn)行了膠霉毒素對稻瘟病菌的孢子萌發(fā)和附著胞形成,以及稻曲病菌的孢子萌發(fā)和次生孢子產(chǎn)生抑制作用的試驗,證實了膠霉毒素具有廣泛的生物活性,進(jìn)而提出菌株TY009具有防治稻瘟病和稻曲病的潛力。膠霉毒素是木霉菌作用于病原菌的生防機(jī)制之一,其對環(huán)境田間的穩(wěn)定性是應(yīng)用的前提。在測定膠霉毒素對熱穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn),隨著加熱時間延長,膠霉毒素溶液加深,還不清楚結(jié)構(gòu)是否已經(jīng)發(fā)生了改變,但其對水稻紋枯病菌的生物活性沒有隨著高溫處理而改變。為了測定pH對膠霉毒素活性的影響,筆者選用稻曲病菌作為研究對象。由于稻曲病菌對膠霉毒素很敏感,在較低濃度下更能反映pH對膠霉毒素活性的細(xì)微差異。這種現(xiàn)象同樣發(fā)生在抑制水稻紋枯病菌的菌落上。在含有20μg·