木霉抑制黃瓜枯萎病菌的拮抗機制研究

屬于半知菌類的假體菌。它廣泛存在于土壤、根、葉、種子和莖等生態(tài)環(huán)境中。生長速度快，產(chǎn)量大，影響譜廣，并能將植株和土壤結(jié)合形成有效的群體。據(jù)統(tǒng)計,木霉至少在體外或體內(nèi)對18個屬29種病原真菌表現(xiàn)出拮抗作用。土傳病害是一類重要的植物病害,主要以土壤為傳播媒介,從植物的根部侵染植株,最后引起植株整株死亡。對土傳病害的防治,目前主要以化學防治為主。由于缺乏理想的高抗品種以及有效的防治藥劑,且化學藥劑對環(huán)境污染的問題日益突出,生物防治越來越引起人們的關(guān)注。關(guān)于木霉對黃瓜枯萎病害的生防作用已有一些研究。木霉的抗生作用受氮源的影響,利用麥麩輔以無機營養(yǎng)作為木霉的固體培養(yǎng)基可以顯著降低枯萎病的發(fā)生,其中對枯萎病發(fā)生的抑制率達52.3%~59.7%。Yang等研究表明,哈茨木霉孢子懸浮液的終濃度為107孢子?mL-1時,可有效降低黃瓜根際土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量。木霉菌可有效提高黃瓜根系對黃瓜尖孢鐮刀菌的抗性,并且可通過激活與脅迫相關(guān)的基因表達提高對鐮刀菌的抗性。木霉可以減輕因植物接種鐮刀菌所造成的激素水平紊亂,這可能是哈茨木霉防治瓜類枯萎病的機制之一。木霉中富含次生代謝物,研究表明,木霉基因組序列中含有一系列與次生代謝物合成相關(guān)的基因,比如非核糖體多肽、聚酮化合物、酚類化合物、萜類化合物和吡喃酮等。次生代謝產(chǎn)物對植物的生長發(fā)育、抵御病蟲害、防紫外輻射及構(gòu)成植物的支撐系統(tǒng)等方面都起著重要作用。木霉可以通過產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物,激活黃瓜中與酚合成相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、脂氫過氧化物裂解酶基因(HPL)的表達,顯著增加酚類化合物含量,從而誘導黃瓜對病原菌的系統(tǒng)抗性。而我們之前的研究也發(fā)現(xiàn),木霉處理在短時間內(nèi)就能誘導黃瓜葉片中與抗性相關(guān)基因(WRKY6、MYB、PR-1、PAL、GST、GLU)的表達。但針對木霉菌與枯萎病菌互作過程中蔬菜植株根系次生代謝酶活性以及抗性相關(guān)基因表達變化還未見報道。本試驗選用3種哈茨木霉菌株TB、TF、TN,篩選了對黃瓜枯萎病菌具有高效生防活性的木霉菌株,并分析了接種木霉對根系次生代謝酶活性及抗性相關(guān)基因表達的影響。1材料和方法1.1供試黃瓜品種黃瓜尖孢鐮刀菌(編號CCF5)FusariumoxysporumSchl.由本課題組分離并保存。哈茨木霉菌菌株TB、TF、TN由浙江大學饋贈。供試黃瓜品種為津研4號。總RNA微提試劑盒購自AxyGEN生物科技公司,RNA純化試劑盒購自Qiagen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司,iQ多色實時定量PCR檢測系統(tǒng)及iQSYBRGreen超混合液購自伯樂公司,引物由上海生工合成。聚乙烯水培箱購自上海美成塑料有限公司。營養(yǎng)液配方采用日本園試配方自行配制。1.2病原菌抑菌率測定采用對峙培養(yǎng)法。木霉菌和病原菌于28℃活化3d。挑取直徑5mm的尖孢鐮刀菌菌塊,接種到新制PDA平板左側(cè),再將木霉菌塊接種到平板右側(cè)。以只接種病原菌平板作對照,每處理3次重復。28℃恒溫培養(yǎng)6d,每天記錄病原菌處理菌落半徑以及對照病原菌菌落半徑,計算抑菌率。抑菌率(%)=(病原菌對照菌落半徑-病原菌處理菌落半徑)/病原菌對照菌落半徑×100%1.3抗氧化酶活性的測定種子消毒后浸種催芽,播于滅菌的濕潤培養(yǎng)基質(zhì)中,兩片子葉時移入聚乙烯水培箱中,水培箱體積為12L,每個水培箱盛有10L營養(yǎng)液,每箱6株,并用電氣泵通氣。營養(yǎng)液的pH和電導率分別為6.5和1.2ms?cm-1。在晝夜溫度28℃/18℃條件下培養(yǎng),相對濕度80%~90%。幼苗3~4片真葉時,將木霉菌孢子懸浮液灌入根部,水培箱中木霉菌孢子懸浮液的終濃度為108孢子?mL-1,3d后灌根接種病原菌孢子懸浮液10mL,水培箱中病原菌孢子的濃度為106個?mL-1,以清水作對照。每處理重復3次,每重復10株。接種病原菌6d時進行測定。肉桂醇脫氫酶(CAD,EC1.1.1.195)活性的測定參照Mitchell等的方法。取新鮮根尖樣品0.3g,加入2mL100mmol·L-1磷酸鉀緩沖液,在冰浴下研磨成勻漿,于4℃,12000g·min-1離心20min,上清液為酶提取液。酶活性測定反應體系:1000μL200mmol?L-1Tris-HCl(pH8.8),700μL10mmol?L-1松柏醇,100μL酶液,200μL10mmol?L-1NADP。測定OD400的動力學變化,測定間隔為20s,吸光系數(shù)為21mmol?cm-1。愈創(chuàng)木酚過氧化物酶活性(G-POD,EC1.11.1.7)活性的測定參照Cakmak和Marschner的方法加以改進。取0.2g新鮮根尖樣品,加入2mL50mmol·L-1磷酸緩沖液,于4℃12000g·min-1離心20min,上清液為酶提取液。取100μL酶液,加1700μL25mmol·L-1磷酸緩沖液(pH7.0,含0.1mmol·L-1EDTA),100μL1%愈創(chuàng)木酚,100μL20mmol·L-1H2O2。測定OD470的動力學變化,測定間隔為20s,吸光系數(shù)為26.6mmol?cm-1。多酚氧化酶活性(PPO,EC1.10.3.1)活性測定反應體系:1400μL25mmol·L-1磷酸緩沖液(pH7.0,含0.1mmol·L-1EDTA),1500μL20mmol·L-1鄰苯二酚,100μL酶液。于28℃下水浴10min,測定OD398吸光值,用不含酶液的混合液作為參比?？Х人徇^氧化物酶(CA-POD,EC1.11.1.7)和綠原酸過氧化物酶(CGA-POD,EC1.11.1.7)的提取方法參照。CA-POD活性測定反應體系:1500μL80mmol·L-1檸檬酸磷酸緩沖液,200μL80mmol·L-1咖啡酸,100μL酶液,200μL35mmol·L-1H2O2。測定OD410的動力學變化。CGA-POD活性的測定取100μL酶液,加1500μL50mmol·L-1磷酸鉀緩沖液,200μL80mmol·L-1綠原酸,200μL35mmol·L-1H2O2。測定OD410的動力學變化。取0.2g新鮮根尖樣品,加入2mL1%HCl的甲醇和少許石英砂在冰浴下研磨成勻漿,用超聲波處理30min。于4℃2000g·min-1離心20min,上清液用于類黃酮含量的測定,含量以O(shè)D325·g-1鮮重表示?？偡雍繙y定用Ruiz等的Folin酚還原法測定。木質(zhì)素含量的測定參照Bruce和West的巰基乙酸法進行。上述指標均重復測定4次。1.4實時定量pcr檢測黃瓜中actin表達水平幼苗2~3片真葉時,用木霉菌TN孢子懸浮液108孢子?L-1灌根,每處理重復3次,每重復6株。以清水作對照。接種處理當天和1、2、4、6、8d后,分別取0.2g新鮮根尖樣品迅速用液氮保存進行RNA提取和基因表達分析?？俁NA用總RNA微提試劑盒提取,以RNA純化試劑盒進行純化。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈,作為實時定量PCR(RT–PCR)的模板。實時定量PCR在iQ多色實時定量PCR檢測系統(tǒng)中進行。25μL反應體系中包含:iQSYBRGreen超混合液12.5μL、cDNA1μL、上下游引物各0.2μmol?L-1。PCR反應程序:95℃預變性3min;95℃變性10s,58℃退火45s,40個循環(huán)。熒光數(shù)據(jù)在每個循環(huán)的退火末期采集。黃瓜中actin基因的熒光值作為計算的內(nèi)標,相對基因表達水平的計算參照Livak&Schmittgen的2-ΔΔC(T)法,重復3次。用于擴增基因的特異引物序列見表1。1.5處理數(shù)據(jù)應用DPSv7.05軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。2結(jié)果與分析2.1不同菌株對木霉病的對抗對峙培養(yǎng)2~3d木霉菌即表現(xiàn)出對病原菌的抑制作用,之后木霉菌繼續(xù)擴展。被包圍的病原菌邊緣稍顯塌陷,長勢減弱。木霉菌和病原菌之間形成了較明顯的抑菌圈,大部分木霉菌在與病原菌的對峙中形成了對抗生長局面,第4d時與枯萎病菌形成了明顯的抑菌圈,之后木霉向病原菌方向擴展,第6天時木霉已經(jīng)覆蓋部分病原菌菌落,其中以TN菌株覆蓋程度最大。其中TN菌株覆蓋或侵入了枯萎病原菌CCF5菌落,拮抗作用較強(圖1)。2.2tn對藥物代謝相關(guān)酶活性的影響接種枯萎病菌增強了黃瓜幼苗根系CAD、PPO、G-POD、CA-POD和CGA-POD次生代謝相關(guān)酶活性,分別較未接種對照增加了43.38%、20.06%、129.68%、50.00%、21.79%和32.20%。同時只接種菌株TN對次生代謝相關(guān)的酶活性也具有顯著的促進作用,與未接種對照相比,各相關(guān)次生代謝酶活性均差異顯著(P<0.05)。與只接種枯萎病菌的植株相比,先接種菌株TN再接種病原菌的植株,CAD、PPO、G-POD、CA-POD和CGA-POD的活性分別提高了1.00倍、0.54倍、2.78倍、1.43倍、0.52倍,同時類黃酮、總酚的含量分別增加1.34倍、1.22倍(表2)。2.3參與植物原生基因表達取接種木霉TN當天和1、2、4、6、8d的黃瓜根系分析抗性基因表達。接種木霉菌植株根系基因的表達量均高于對照植株。接種木霉菌1d即引起了抗病防御蛋白基因PR-1和PAL(圖2D、F)的表達,2d引起了參與植物次生代謝相關(guān)基因C4H、CAD、CCOMT、G6PDH(圖2A、B、C、E)的表達。處理第3d,這一系列基因的表達量顯著下降,但到第6d時,表達量又出現(xiàn)了一個峰值。并且除咖啡酰CoA氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因(CCOMT)外,第6d的基因表達量高于第2d。C4H、CAD、CCOMT、G6PDH、PAL和PR-1的表達量分別為對照的5.64、5.31、4.28、15.33、7.36和6.45倍(圖2)。3木霉調(diào)控植物伴生代謝光合作用作為植物重要的初生代謝過程,為植物的生長、發(fā)育和生殖提供了物質(zhì)能量及信息,而木霉通過調(diào)節(jié)初生代謝從而起到促進植株生長和作物產(chǎn)量的作用。植物的初生代謝和次生代謝緊密相連,次生代謝在植物對環(huán)境的適應性和對脅迫的抗性上充當著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖、酵母提取物、β-葡聚糖、菌絲提取物等誘導子均能夠促進次生代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)的積累,對植物的抗逆反應至關(guān)重要[22~25]。但是,木霉對次生代謝的直接作用一直缺乏證據(jù)。我們的研究發(fā)現(xiàn)木霉可有效提高總酚、類黃酮、木質(zhì)素含量。而酚類化合物和類黃酮可清除ROS等自由基,木質(zhì)素和類黃酮更是直接參與植物的防御系統(tǒng)。這些結(jié)果表明,木霉能夠促進植物次生代謝的進程來緩解生物脅迫。木霉能夠調(diào)控次生代謝產(chǎn)物,這與木霉處理短時間內(nèi)即誘導CAD、G-POD、CA-POD、CGA-POD和PPO活性的上升有關(guān)。CAD是催化木質(zhì)素前體合成的最后一步限速酶,因而通過降低或提高其活性可減少或增加木質(zhì)素的合成。POD也在植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成中起到非常重要的作用,其活性與酚類化合物含量成正比。而PPO參與植物抗逆過程,可催化單酚氧化成二酚或多酚,再氧化生成醌,然后與某些特定的氨基酸形成二聚體或多聚體,最后形成鄰二酚型黑色素。許多研究表明,上述次生代謝相關(guān)酶在植物抵御