木霉生防菌劑對(duì)番茄枯萎病的室內(nèi)盆栽防治試驗(yàn)

蘑菇是一個(gè)嚴(yán)重的有害食品遺傳病原體，可能會(huì)導(dǎo)致各種作物疾病。隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,河北省各地蔬菜種植面積逐年擴(kuò)大,由尖鐮孢菌引起的立枯病發(fā)生比較普遍,危害嚴(yán)重。目前使用化學(xué)殺菌劑防治,其藥效持續(xù)時(shí)間短,農(nóng)民用藥次數(shù)和劑量逐步增加,農(nóng)藥殘留在蔬菜和土壤中蓄積量也逐漸增加。這種情況在溫室大棚蔬菜栽培中尤為突出,對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大危害。因此,研制藥效持久,且對(duì)人體和生態(tài)環(huán)境無(wú)害的生防菌劑替代化學(xué)農(nóng)藥成為我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)的發(fā)展方向。拮抗性木霉是一種很好的生防微生物,它通過(guò)重寄生、胞外酶降解、產(chǎn)生抗生素等一系列拮抗作用能有效抑制許多病原菌的活動(dòng),對(duì)多種真菌性土傳病害有明顯的生防效果。1材料和方法1.1試驗(yàn)中的菌株和材料木霉菌株T41和尖鐮孢菌由本研究室分離、保存。50%多菌靈可濕性粉劑,由河北邢臺(tái)農(nóng)藥廠(chǎng)生產(chǎn)。1.2測(cè)試方法1.2.1病原菌培養(yǎng)和觀(guān)察制備PDA平板,將木霉T41和尖鐮孢菌點(diǎn)接在相對(duì)平板邊緣,倒置放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中,作對(duì)峙培養(yǎng),重復(fù)3次。定期觀(guān)察木霉對(duì)病原菌的抑制作用,并記錄菌落生長(zhǎng)半徑及相互作用。同時(shí)做木霉T41和尖鐮孢菌的純培養(yǎng)試驗(yàn)并記錄菌落滿(mǎn)皿時(shí)間。1.2.2抗抑郁藥在對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中,在兩菌落的交接處形成對(duì)峙界面,挑取界面處的菌絲做涂片,在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察兩種菌絲的交接情況。1.2.3發(fā)酵期活力弱木霉菌的發(fā)酵以往都采用液體深層發(fā)酵但得到的芽生孢子壽命短,活力弱,活性菌體含量低。而固體發(fā)酵的生產(chǎn)周期較長(zhǎng),菌劑含量低,生產(chǎn)成本高。我們以麩皮為原料,采用液—固兩相發(fā)酵工藝,在控制適當(dāng)條件下可得到孢子含量較高的木霉菌劑。(1)木霉t21菌種的培養(yǎng)取麩皮1.0g,裝入250ml三角瓶中,加水99ml,高壓滅菌后,接入木霉T41菌種,在恒溫28℃搖床上進(jìn)行培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為180r/min培養(yǎng)30h左右,接入固體培養(yǎng)基。(2)固體發(fā)酵的制備取麩皮8g,放入250ml三角并中,將培養(yǎng)好的液體發(fā)酵液按10%(V/W)的量,加入固體培養(yǎng)基,攪勻后,平放于30℃的恒溫箱中保持一定的濕度進(jìn)行固體發(fā)酵。生產(chǎn)的生防菌劑供防效試驗(yàn)用。1.2.4木霉菌對(duì)番茄枯渙病病原菌的覆蓋番茄枯萎病俗稱(chēng)萎蔫病,病原菌屬半知菌亞門(mén),鐮孢屬尖鐮孢菌?；ㄅ柚睆?4cm,盆內(nèi)為無(wú)菌土,每盆種植10株番茄苗,木霉菌劑用麩皮稀釋到孢子含量為1×108個(gè)/g,設(shè)3個(gè)對(duì)比處理:(1)木霉菌劑施用量2g/株;(2)多菌靈800倍液300ml/株;(3)空白,清水對(duì)照。當(dāng)番茄苗長(zhǎng)出2~3片復(fù)葉時(shí),按上述木霉菌劑量施在秧苗根際,上面用無(wú)菌土覆蓋2~3cm。一天后接入番茄枯萎病病菌分生孢子懸浮液(孢子含量1×105個(gè)/ml)。接種前用小刀破壞根系,每株接入3ml孢子懸浮液,用50%多菌靈800倍液和清水作對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù),記錄秧苗發(fā)病情況。2結(jié)果與分析2.1抗抑郁藥2.1.1木霉t21對(duì)病原菌生長(zhǎng)和分生孢子叢生長(zhǎng)的影響木霉T41生命力極強(qiáng),生長(zhǎng)快,其純培養(yǎng)的滿(mǎn)皿時(shí)間與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)的滿(mǎn)皿時(shí)間基本相同,菌落半徑也相差不大;而尖鐮孢菌與T41對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)的菌落半徑卻相差很大。這說(shuō)明木霉T41競(jìng)爭(zhēng)力較強(qiáng),對(duì)病原菌生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用,并能直接在病原菌菌落上長(zhǎng)出菌絲和分生孢子叢,基本不受病原菌的影響。在兩菌絲相交處,由于木霉的重寄生和空間、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用,使病原菌菌絲變黃、斷裂。隨著木霉菌的擴(kuò)展,病原菌菌落也被木霉菌絲覆蓋,停止生長(zhǎng)或死亡。對(duì)峙培養(yǎng)和純培養(yǎng)的菌落半徑見(jiàn)表1。2.1.2綠色木霉病氣生病原菌絲覆蓋顯微鏡下觀(guān)察對(duì)峙結(jié)果發(fā)現(xiàn),在木霉與尖鐮孢菌交接處形成對(duì)峙面,界面處病菌菌絲被木霉菌絲重寄生或木霉用吸器進(jìn)入病原菌絲,吸取菌絲營(yíng)養(yǎng),使病菌營(yíng)養(yǎng)菌絲逐漸失活;氣生菌絲逐漸被消滅、解體,最后均被綠色木霉孢子所覆蓋;尖鐮孢菌氣生菌絲完全被抑制,覆蓋率為97%。通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)木霉T41的拮抗作用主要有以下3種方式。(1)木霉分生孢子引起病菌病原菌．木霉菌絲以纏繞、穿插、緊貼等方式寄生于尖鐮孢菌上,并產(chǎn)生木霉分生孢子,使病菌菌絲變形,細(xì)胞變短。木霉菌絲產(chǎn)生的圓形吸器侵入病原菌菌絲,吸取營(yíng)養(yǎng),致使病原菌菌絲從隔膜處斷裂、解體。(2)糖酶抑制了尖鐮孢菌生長(zhǎng)和芽孢芽孢桿菌萌發(fā)的作用由于木霉能產(chǎn)生多種降解細(xì)胞壁的胞外酶(如幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶)對(duì)尖鐮孢菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用,致使病菌菌絲停止生長(zhǎng)。由于木霉能產(chǎn)生膠霉毒素或抗生物質(zhì),使病菌菌絲細(xì)胞質(zhì)消解或使菌絲原生質(zhì)凝結(jié),并逐漸腐爛、失活、解體,有時(shí)還發(fā)生自溶或外溶現(xiàn)象。(3)木霉菌絲覆蓋木霉菌爭(zhēng)奪尖鐮孢菌生活空間,使病菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制,扭曲。表現(xiàn)為環(huán)行生長(zhǎng),菌絲頂部變細(xì),內(nèi)容物減少,最后被木霉菌絲覆蓋。顯微鏡下發(fā)現(xiàn),多為木霉菌絲和正在解體的病原菌菌絲碎段,病菌孢子量較少,而木霉孢子量很多。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:木霉T41和病原菌的交接面處,木霉孢子占90%以上,在病菌接種點(diǎn)處的木霉孢子量仍達(dá)82%以上。2.2木霉菌可濕性制劑田間效果的觀(guān)察和防治試驗(yàn)處理23d時(shí),對(duì)照的番茄苗已基本枯死,而木霉菌劑處理的秧苗仍健康生長(zhǎng),與多菌靈處理的秧苗相比,植株健壯、高大,根系發(fā)達(dá),結(jié)果見(jiàn)表2。施用木霉菌劑的生防效果達(dá)86.53%,優(yōu)于800倍液多菌靈可濕性粉劑和對(duì)照試驗(yàn),與其他處理之間的防效差異顯著。田間直觀(guān)效果表現(xiàn)為木霉制劑處理的秧苗植株粗壯,葉片深綠,根系發(fā)達(dá),鮮根重比多菌靈處理的增加5%,株高增加22cm,有明顯的增長(zhǎng)效果。由于加入了一定量的麩皮作稀釋營(yíng)養(yǎng)劑,使施入的木霉菌劑能長(zhǎng)出較多較長(zhǎng)的菌絲,可以延伸到植株根圍較大范圍,抑制病原菌生長(zhǎng)。麩皮不僅起到稀釋劑的作用,而且為木霉的長(zhǎng)期定殖于植物根際提供了大量必需的營(yíng)養(yǎng),提高了防治效果,而且還改善了根際原有的生態(tài)環(huán)境,使植物根系發(fā)達(dá),植株健壯,對(duì)植物的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。3生物炭對(duì)土壤細(xì)菌的活性木霉T41菌劑對(duì)番茄枯萎病的防治主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用,同時(shí)木霉在生長(zhǎng)過(guò)程中還能產(chǎn)生抗生素和胞外酶,使病菌菌絲的細(xì)胞質(zhì)消解,菌絲斷裂、溶解消