抗腫瘤藥品藥效學指導原則我的研究-5-首頁#B-b:l:q7u\u001Dk\u001AL一、基本原則1.抗腫瘤藥品分類(1)細胞毒類藥品(cytotoxicagent)：涉及干擾核酸和蛋白質合成、克制拓撲異構酶及作用于微管系統(tǒng)的藥品等；(2)生物反映調節(jié)劑(biologicalresponsemodifier)；(3)腫瘤耐藥逆轉劑(resistancereversalagent)；(4)腫瘤治療增敏劑(oncotherapysensitizer)；(5)腫瘤血管生成克制劑(tumorangiogenesisinhibitor)；(6)分化誘導劑(differentiationinducingagent)；(7)生長因子克制劑(growthfactorinhibitor)；(8)反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)。2.抗腫瘤藥品藥效學需研究內容2.1

涉及體外抗腫瘤實驗，體內抗腫瘤實驗。2.2

評價藥品的抗癌活性時，以體內實驗成果為主，同時參考體外實驗成果以做出對的的結論。2.3

I類抗腫瘤新藥應進行藥品作用機制初步研究。二、體外抗腫瘤活性實驗1.實驗目的1.1對候選化合物進行初步篩選；1.2理解候選化合物的抗瘤譜；1.3為隨即進行的體內抗腫瘤實驗提供參考，如劑量范疇、腫瘤類別等。2.實驗辦法選用10-15株人癌細胞株，根據實驗目的選擇對應細胞系及適量的細胞接種濃度，按常規(guī)細胞培養(yǎng)法進行培養(yǎng)；推薦使用四氮唑鹽MTT還原法、XTT還原法、磺酰羅丹明B染色法、或51Cr釋放實驗、集落形成法等測定藥品的抗癌作用。藥品與細胞共培養(yǎng)時間普通為48-72小時，貼壁細胞需先貼壁24小時后再給藥。實驗應設陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的原則抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照。3.評價原則以同同樣品不同濃度對腫瘤細胞克制率作圖可得到劑量效應曲線，然后采用Logit法計算半數有效濃度(IC50值或EC50值)。體外實驗最少重復一次。附注：評價藥品抗癌活性的辦法：1.

MTT還原法1.1

基本原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide]是一種能接受氫原子的染料?；罴毎€粒體中與NADP有關的脫氫酶在細胞內可將黃色的MTT轉化成不溶性的藍紫色的甲[月替](formazan)，而死的細胞則無此功效。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波長下用酶標儀測定光密度值，即可定量測出細胞的存活率。1.2操作環(huán)節(jié):1.2.1選用對數生長久的貼壁腫瘤細胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基配成5000個／ml的細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μl，37℃1.2.2實驗組換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設3～5平行孔，37℃1.2.3棄去上清液，每孔加入200μl新鮮配制的含0.2mg／mlMTT的無血清培養(yǎng)基．37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200μlDMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標儀上以實驗波長為570nm，參比波長為450nm測定光密度值。1.3成果評定:按下式計算藥品對腫瘤細胞生長的克制率：腫瘤細胞生長克制率％＝(1-OD實驗/OD對照)×100％以同同樣品的不同濃度對腫瘤細胞生長克制率作圖可得到劑量反映曲線，從中求出樣品的半數殺傷濃度IC50。合成化合物或植物提取純品的IC50＜10μg／m1或植物粗提物的IC50＜20μg／m1時，則判斷樣品在體外對腫瘤細胞有殺傷作用。2.生長曲線法的基本原理：在最適條件下，腫瘤細胞在培養(yǎng)液中呈指數生長，如取細胞數的對數與培養(yǎng)時間作圖可得一條直線，故稱此時為對數生長久。隨著細胞密度不停增高，由于代謝產物的積聚及營養(yǎng)物的消耗，細胞生長逐步減慢以致停止，此時稱高坪期或穩(wěn)定時。因此藥品對細胞生長的影響可通過生長曲線反映出來。3.染料排斥實驗的基本原理：活細胞有排斥某些染料如伊紅、臺盼藍、苯胺黑等的能力，而死細胞由于膜完整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細胞中加入這些染料，一定時間后，對著色和未著色的細胞進行計數，即可算出被殺死的細胞比例。4.集落形成法的基本原理：克隆原細胞含有持續(xù)增殖能力，當單個細胞分裂6代或6代以上時，其后裔所構成的群體(集落)便含50個以上細胞。通過集落計數可對克隆原細胞作定量分析。它反映了單個細胞的增殖潛力，故能較敏捷地測定抗癌藥的活性，日前被認為是一種較抱負的檢測辦法。慣用的集落形成法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)法兩種。5.SRB法的基本原理：SRB(sulforhodamine是一種蛋白質結合染料，粉紅色，可溶于水。SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結合。其在515nm波長的OD讀數與細胞數呈良好的線性關系。故可用作細胞數的定量。MTT法的一種缺點是OD值可隨放置時間而變，而SRB法無此現象。因此更合用于進行大規(guī)模的實驗。三、體內抗腫瘤實驗體內抗腫瘤實驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中最少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。實驗成果三種模型均為有效，再重復一次也為有效，評定該化合物對這些實驗性腫瘤含有治療作用。激勵使用人類腫瘤裸鼠移植瘤模型和多個類的移植瘤模型、原位接種模型和中空纖維測定(hollow-fiberassay)等辦法。1.動物動物規(guī)定健康，符合等級動物規(guī)定，有實驗動物合格證。雌雄均可，但同一批實驗中動物性別必須相似。小鼠鼠齡為5-6周，體重為18-22克。評價同一物質的活性時，不同批次的實驗必須采用同一品系的小鼠。2.腫瘤模型2.1

小鼠腫瘤模型淋巴細胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網織細胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及多個小鼠腫瘤的亞型和耐藥株等。2.2人癌裸小鼠移植瘤模型應選用體外實驗敏感細胞株進行體內抗人癌裸小鼠移植瘤實驗。模型建立和使用應注意：(1)

移植瘤普通由對應的細胞株移植而建立，對細胞株和移植瘤的化療敏感性應予理解。(2)

移植瘤復蘇后普通應傳2-3代后再用于體內抗腫瘤實驗。(3)

對模型生長狀況應全方面理解，特別是生長快的模型(4)

為了保持移植瘤的生物學特性和遺傳特性，復蘇后移植瘤體內傳代應少于15-20代3.實驗過程3.1接種：腫瘤接種辦法重要有皮下接種、腹腔接種和原位接種。3.1.1皮下腫瘤模型選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下（超凈臺或接種罩），用碘酒、酒精或新潔爾滅消毒動物皮膚，切開皮膚，剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5mm3左右，用套管針接種于動物一側或雙側腋窩皮下；或制成細胞懸液，然后按一定比例加入無菌生理鹽水，普通每只小鼠接種腫瘤細胞數量為（1-5）×106。3.1.2腹水瘤模型無菌條件下，消毒動物皮膚，吸取生長良好的動物腹水，以生理鹽水按一定比例稀釋后接種于動物腹腔，接種細胞數量普通為（1-5）×106。3.1.3原位接種模型原位接種是指將來源于某臟器的腫瘤接種在動物的某臟器，如將人肝癌接種在裸小鼠的肝臟。原位接種不是常規(guī)的辦法，但有其優(yōu)越性，是激勵使用的辦法。重要有肺、肝、胃、腸、乳腺、顱內等原位接種辦法。3.2動物分組3.2.1實驗設陰性對照組、陽性對照組、治療組。3.2.2治療組設高、中、低三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接種后次日將動物隨機分組。裸鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100—300mm3后將動物隨機分組。3.2.3

動物數普通小鼠每組10只，裸鼠6只。陰性對照組動物數為治療組動物數×實驗組數1/23.3劑量設立3.3.1治療組設高、中、低劑量治療組，普通按4:2:1設立，高劑量使用最大耐受量或LD10的劑量。3.3.2

陰性對照組予以對應的溶劑；3.3.3

陽性對照藥選用對該動物敏感的、臨床應用的抗腫瘤藥品，3.3.4

如受試物為一抗癌藥品的衍生物或類似物時，必須選用該抗癌藥品作為陽性對照藥。3.4陽性對照藥選擇原則療效確切；與被試物質化學構造類似；與被試物質有類似的作用機理。3.5藥品配制溶于水的藥品，用生理鹽水或蒸餾水配制；如用酸、堿溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5NHCl)或堿(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，調節(jié)pH在4.5-9.0的范疇內。用乙醇、丙二醇、吐溫80、DMSO助溶的藥品，或用吐溫60、吐溫80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纖維素制成混懸液的藥品，可腹腔注射或口服，但必須設相似濃度的溶劑對照組。用注射用花生油配制的溶液或乳劑可口服、皮下或肌肉注射。3.6給藥方案和給藥途徑分組當天開始給藥，根據不同藥品的代謝動力學和毒性反映等擬定給藥方案。給藥途徑應與推薦臨床用藥的途徑相似。給藥次數較多，或被試物質溶解性較差，靜脈給藥有困難時，可考慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種給藥途徑是有差別的?？刹捎昧鲋堋⒘鰞?、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤實驗時普通不能應用腹腔給藥途徑。4評價原則4.1腹水瘤模型接種給藥后，觀察和統(tǒng)計動物死亡時間，計算生存天數。如陰性對照組20%動物存活時間超出4周，表明腹水瘤生長不良，實驗作廢。采用中位生存時間（即mediansurvivaltime,MST）來評價每組的生存時間，其計算公式為：每組鼠數的中間數-中間生存天數前死亡的鼠數MST=（中間生存天數-0.5）+中間生存天數死亡的鼠數治療組與對照組的比較，采用T/C（%）來表達，計算公式為：

TMSTT/C%=────×100%

CMSTTMST：治療組MST；CMST：陰性對照組MST。評價原則以125%為界，當T/C%≥125%時。視為有效，反之則無效。4.2裸鼠移植瘤模型推薦使用測量瘤徑的辦法，動態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應。腫瘤直徑的測量次數根據移植瘤的生長狀況而定，普通為每七天2-3次,每次測量同時還需稱鼠重。腫瘤體積(tumorvolume,TV)的計算公式為：V=1/2×a×b2或π/6×a×b×c其中a、b、c分別表達長寬高。兩公式的有關性極好，可采用任一公式。根據測量成果計算出相對腫瘤體積（relativetumorvolume，RTV），RTV=Vt/V0。其中V0為分籠給藥時(即d0)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積?？鼓[瘤活性評價指標為相對腫瘤增殖率T/C（%）

TRTVT/C%=────×100%

CRTVTRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV。療效評價原則：T/C%>40%為無效；T/C%≤40%，并經統(tǒng)計學解決P<0.05為有效。4.3小鼠腫瘤模型生長較慢小鼠腫瘤采用與裸鼠移植瘤同樣的測量瘤徑的評價辦法。生長較快小鼠腫瘤可采用稱瘤重的辦法評價。實驗結束后處死動物，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。陰性對照組腫瘤平均瘤重不大于1克，或20%腫瘤重量不大于400毫克，表達腫瘤生長不良，實驗作廢。療效評價公式：

給藥組平均瘤重-陰性對照組平均瘤重腫瘤生長克制率=────────────────────×100%

陰性對照組平均瘤重評價原則：腫瘤生長克制率<40%為無效；腫瘤生長克制率≥40%，并經統(tǒng)計學解決P<0.05為有效。4.4原位接種模型不同原位接種模型可采用不同評價辦法，重要有瘤重和生存時間評價法。如肝原位接種可用瘤重評價，顱內接種可用生存時間評價。評價辦法、原則和注意事項同腹水瘤模型和小鼠腫瘤模型。四、抗腫瘤藥品的特殊規(guī)定I類抗腫瘤新藥應進行藥品作用機制的初步研究。非細胞毒類藥品除完畢體內外抗腫瘤實驗，還應進行特定抗腫瘤作用研究。1.生物反映調節(jié)劑藥效學涉及：體內抗癌實驗和免疫功效研究。1.1

體內抗癌實驗注意點：模型：裸鼠是免疫缺點動物，普通應用正常免疫鼠腫瘤模型。給藥時間：可按常規(guī)給藥，也可在接種前預先給藥，接種后繼續(xù)給藥或停藥。腫瘤細胞接種量：可比細胞毒類藥品低一種數量級，普通為(1-5)?105個瘤細胞/小鼠。給藥辦法：可單獨給藥，也可與其它抗腫瘤藥品合并使用，觀察增效或減毒作用。1.2

免疫功效實驗辦法含有抑瘤作用的生物反映調節(jié)劑，還需作免疫功效測定,以明確其抑瘤作用與否與免疫功效調控有關。免疫功效測定涉及細胞免疫和體液免疫兩方面。免疫功效測定有：（1）

巨噬細胞功效測定（2）

天然殺傷細胞(naturalkillcell)測定（3）

淋巴細胞轉化實驗（4）

淋巴因子活化的殺傷細胞測定(lymphocyte-activatedkillercell)（5）

多個細胞因子測定，如IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。（6）

遲發(fā)型超敏反映檢測2.腫瘤耐藥逆轉劑2.1

體外抗耐藥活性實驗選擇2-3對腫瘤耐藥/敏感細胞株，采用MTT法或SRB法測定細胞毒性。普通在無毒劑量或相稱于IC10的劑量下設三個劑量，并設立對應的陽性和陰性對照組。評價逆轉效果用逆轉倍數(foldreversal,FR)表達：FR=IC50(不加逆轉劑)/IC50(加逆轉劑)。注意的方面：耐藥株的耐藥性：耐藥株因傳代，特別是撤藥后耐藥性可變化或消失；實驗前必須對實驗耐藥株進行耐藥倍數(FR)測定，確保實驗的可*性。若非逆轉多藥耐藥(MDR)而是逆轉單藥耐藥，則實驗的瘤株中需有針對該藥的耐藥細胞株。陽性對照藥建議采用維拉帕米(verapamil)10μM環(huán)孢菌素A(cyclosporinA)3μM。2.2

體內抗腫瘤耐藥活性實驗小鼠敏感和對應的耐藥腫瘤和人癌裸鼠敏感和對應的耐藥移植瘤。2.3耐藥基因及其體現產物測定可測定腫瘤細胞內的藥品濃度變化和耐藥基因及其體現產物，初步明確其逆轉耐藥機制。涉及多藥耐藥基因及其編碼蛋白(multidrugresistancegene/p-glycoprotein,Mdr1/Pgp)、多藥耐藥有關蛋白(multidrugresistance-relatedprotein,MRP)、肺耐藥有關蛋白(lungresistance-relatedprotein,LRP)、其它與耐藥有關的基因/蛋白及酶等。3.抗腫瘤轉移藥品腫瘤與否轉移不僅依賴于腫瘤細胞本身含有的內在轉移潛能，并且也取決于機體抗轉移因素的消長。因此，抗轉移藥品只有在動物體內模型上才干得出符合實際的成果。3.1體外實驗測定候選化合物作用下腫瘤細胞對基底膜的侵襲、粘附和腫瘤細胞趨化性運動的能力。3.2體內實驗3.2.1模型：小鼠B16黑色素瘤、小鼠Lewis肺癌等和人癌裸鼠移植高轉移瘤模型。3.2.2接種辦法：慣用靜脈注射辦法，也可用皮下接種等辦法。3.2.3評價指標接種給藥后，觀察統(tǒng)計動物死亡時間，計算生存天數。實驗結束后，稱動物體重、肺重、移植瘤重，解剖顯微鏡下計數肺轉移瘤灶、測瘤徑(計算肺轉移瘤體積)和病理組織學切片觀察等；計算轉移率轉移克制率=1-(治療組轉移率/對照組轉移率)×100%。4.腫瘤血管生成克制劑4.1體外實驗體外實驗模型有:（1）人血管內皮細胞模型：人臍靜脈血管內皮細胞和人微血管（肺、皮膚等）內皮細胞。（2）血管形成增進因子等刺激細胞DNA合成、增殖、遷移、血管形成(tubeformation)來觀察藥品的抗血管形成作用。如血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)或堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)（3）腫瘤細胞模型：重要應用國內已建立的人實體癌細胞系，擬定VEGF、FGF等高分泌的細胞株。檢測細胞增殖、轉移能力及血管形成因子的基因體現狀況來評價藥品。4.2體內實驗4.2.1血管克制實驗典型的血管形成評價辦法有：雞絨毛膜尿囊和卵黃膜囊（CAM）、嚙齒動物虹膜和角膜等。也可用如皮下移植塑料或多孔的polytetrafluoroethylene管、皮下移植無菌的海綿；某些自然的或化學修飾的物質如Matrigel和纖維凝膠等用于體內模型。4.2.2

抗腫瘤實驗通過觀察新生血管生成克制劑的體內抗腫瘤效應檢測移植瘤的血管密度、血管生成因子和克制因子的分泌和體現，以及腫瘤的轉移狀況等綜合評價腫瘤血管生成克制劑的作用和作用機制。5.分化誘導劑分化誘導劑的藥效學研究涉及體外和體內研究模型；現在的藥品重要能對急性白血病進行有效的分化治療