堆型艾美耳球孢子分離純化條件的研究

雞蟲病是影響雞業(yè)最重要的原生動物之一。堆型艾美耳球蟲主要寄生于雞小腸上段的十二指腸,通常引起慢性疾病,造成飼料轉化率低,生長緩慢,是嚴重影響生產性能的球蟲之一。目前對柔嫩艾美耳球蟲的研究發(fā)現(xiàn),很多存在于子孢子的蛋白具有良好的免疫原性,如Danforth、Jenkins和Dame報道子孢子中的抗原成分,并應用針對此成分的單克隆抗體達到抑制蟲體入侵的功效。在新藥物的研究開發(fā)方面,很多抗球蟲藥的作用機制是阻斷球蟲體內的信號轉導或抑制入侵相關蛋白分泌。由于雞體試驗相對繁瑣,環(huán)境相對復雜,很多實驗室采用體外入侵的方法進行研究,子孢子純化是上述研究發(fā)展的重要基礎。目前對于柔嫩艾美耳球蟲子孢子純化的研究較多,而堆型艾美耳球蟲的子孢子純化的研究較少。筆者以蔗糖作為介質,利用蔗糖密度梯度獲得較純凈子孢子,此方法較為簡便且經濟高效。1試驗材料和方法1.1落地前國球蟲養(yǎng)殖海藍灰蛋雞,購自北京昌平種雞場,未落地前運回飼養(yǎng)于無球蟲的籠舍中;飼料為全價雛雞料,不含任何藥物添加劑,55℃烘箱過夜,以殺死可能存在的卵囊。1.2卵囊的制備雞堆型艾美耳球蟲株,由河北農業(yè)大學秦建華饋贈。以每只10萬孢子化卵囊的劑量感染7日齡海藍灰蛋雞,感染5d后取十二指腸內容物,經次氯酸鈉處理5min,用飽和食鹽水漂浮法收集卵囊,置2.5%重鉻酸鉀溶液中,28℃空氣浴震蕩器中48h孢子化,待卵囊90%孢子化后,置4℃冰箱中保存。1.3組大鼠輸注后b.10%胰酶、pbs液、雙抗的配制雙抗配置:取100萬單位青霉素和100萬單位鏈霉素溶于100mL三蒸水中,-20℃保存。取新鮮雞膽汁針孔式濾器抽濾后,與胰酶、PBS液、雙抗配制成4組脫囊液:A.10%雞膽汁(V/V)+1%胰酶(W/V)+1萬IU/mL雙抗;B.10%雞膽汁(V/V)+0.75%胰酶(W/V)+1萬IU/mL雙抗;C.5%雞膽汁(V/V)+1%胰酶(W/V)+1萬IU/mL雙抗;D.5%雞膽汁(V/V)+0.75%胰酶(W/V)+1萬IU/mL雙抗。1.4組織研磨器洗去孢子化卵囊的重鉻酸鉀后,加到組織研磨器中并在冰水中研磨。不斷在顯微鏡下觀察,直至90%左右的球蟲卵囊破壁即可,離心棄去上清。1.5不同配方脫囊液觀察將含有孢子囊的溶液分別加入到A,B,C,D4種不同配方的脫囊液中,40℃水浴,邊消化邊鏡檢,在顯微鏡下,不斷觀察脫囊情況,30min后停止消化。1.6加回不同離心管配制20%,30%,65%,70%,75%,80%的蔗糖溶液。先將65%,70%,75%,80%的蔗糖溶液分別加到不同離心管中,再用滴管分別將20%,30%蔗糖溶液依次加到離心管中,并做好標記。并將含有子孢子的脫囊液滴入,1500r/min,離心10min,吸取2種溶液間的白色條帶。加入PBS液3000r/min離心15min,洗滌蔗糖溶液,計算回收率(純化后子孢子數(shù)/脫囊后計數(shù))。1.7子芽孢子芽孢子粒的制備用不同的脫囊液脫囊的子孢子經過同樣的方法純化后,將純化好的子孢子用PBS定容到2mL,吸取1滴子孢子液滴在載玻片上再加入2滴伊紅Y染液。2min后在顯微鏡下觀察。計算子孢子的存活率(染色后未見伊紅顏色子孢子數(shù)/總子孢子數(shù))。2試驗結果與分析2.1組脫囊效果對比經過統(tǒng)計分析,結果表明,脫囊液A的脫囊效果與脫囊液B的效果有顯著性差異(P<0.05),其他2組的脫囊效果與脫囊液B組都有極顯著差異(P<0.01),說明脫囊液B的脫囊效果最好。另外,脫囊液B脫囊后的存活率也均高于其他組,證明這4種脫囊液中,脫囊液B做為堆型艾美耳球蟲脫囊液,對堆型艾美耳球蟲子孢子影響最小(表1)。2.2子孢子孢子束的制備在顯微鏡下(1000倍)觀察可以看到活的子孢子有良好的活動性且不呈現(xiàn)紅色,呈彎月形;死的子孢子,膨脹為梭形或橢圓形,整體呈現(xiàn)淡紅色。2.3最佳子芽孢回收率經過統(tǒng)計分析,75%和20%除與80%和20%組之間為顯著差異(P<0.05),與其他各組都是極顯著差異(P<0.01),說明75%和20%蔗糖梯度之間的子孢子回收率是最高的。證明在這8種不同蔗糖密度梯度中,75%和20%蔗糖密度梯度離心分離堆型子孢子是有效的方法(見表2)。3不同動物對材料分離效果的研究在研究子孢子表面抗原和子孢子入侵細胞的相關機制時,離不開純凈的子孢子,研究新型疫苗和新的藥物時也需要純凈的子孢子。此外,純凈的子孢子還可以用于球蟲的免疫學、生物化學及分子生物學等方面的研究。國內的研究者采用兩步進行子孢子脫囊。第一步是物理方法破壞卵囊壁,主要有玻璃珠震蕩或用超聲波振蕩破壞,但由于超聲波振蕩過程中產生大量熱量對子孢子活性有較大影響,筆者選擇在冰水中用玻璃研磨器來破壞卵囊壁。第二步是用消化液來消化孢子囊。有研究用4%牛膽磺酸鹽,0.25%的胰酶利用HBSS在40℃水浴中使柔嫩艾美耳球蟲子孢子脫囊。有研究用10%的豬膽汁,1%胰酶的生理鹽水來使柔嫩艾美耳球蟲子孢子達到80%脫囊。在王卓的研究中利用0.25%的胰酶,0.75%牛膽磺酸鹽60～90min可以達到90%的脫囊。由于膽磺酸鹽的造價比較高,而膽汁容易獲得,所以現(xiàn)在大部分脫囊選擇膽汁。比較各種動物的膽汁對于柔嫩艾美耳球蟲的脫囊效果,0.25%胰蛋白酶和0.75%TDC脫囊45min效果最好,其次是0.25%胰蛋白酶和10%雞膽汁脫囊75min。這些研究結果都來自柔嫩艾美耳球蟲,而堆型艾美球蟲脫囊研究較少。文獻中的柔嫩艾美耳球蟲脫囊時間大概都在60min到90min,本試驗結果顯示堆型艾美耳球蟲在很多方面與柔嫩艾美耳球蟲是有著很大不同的。從試驗的結果可以看出30min的時候脫囊率已經可以達到90%,當60min的時候檢測4種脫囊液中,已經幾乎見不到堆型艾美耳球蟲的子孢子,筆者推測大部分子孢子崩解,證明堆型艾美耳球蟲的孢子囊壁相對于柔嫩艾美耳球蟲的孢子囊壁對于脫囊液的抵抗力較弱,這可能與這兩種球蟲的寄生部位不同有一定關系,柔嫩艾美耳球蟲寄生部位相對較深,脫囊時間較長有利于子孢子進入寄生部位;而堆型艾美耳球蟲寄生部位比較靠上部,脫囊時間短有利于子孢子進入小腸上部,這種推論是否正確有待進一步研究。而且在不同濃度的胰酶作用時子孢子的存活率也不相同。0.75%的胰酶組比1%的胰酶組的子孢子存活率都相對較高,證明胰酶對于子孢子是會產生傷害的。所以在選擇脫囊液時不宜選擇過高的胰酶濃度。0.75%胰酶,10%膽汁組脫囊率和存活率都較高,是一種比較理想的脫囊液。分離純化子孢子的方法很多。SchmatzDM等人研究使用DEAE-52陰離子交換樹脂來分離球蟲子孢子。DulskiP等人利用硅膠密度梯度離心法分離柔嫩艾美耳球蟲的子孢子。蔣建林等人的研究表明,利用DEAE-52分離柔嫩艾美耳球蟲的子孢子和第二代裂殖子回收率達到87%。王建民在研究中指出,利用蔗糖密度梯度離心法分離柔嫩艾美耳球蟲子孢子30%和60%蔗糖溶液間的子孢子純化最好,基本上沒有雜質,回收率可以達到84.5%。由于DEAE-52纖維素和甘氨酸都是比較昂貴且處理過程復雜,而且DEAE-52纖維素回收之后再生利用純化能力明顯下降。而用蔗糖作為介質,不僅純化效果良好,而且費用低廉,操作簡便。所以,本試驗利用蔗糖密度梯度離心法分離堆型艾美耳球蟲子孢子,結果顯示在20%和75%之間的回收率最高,且雜質很少,可以滿足試驗需要,最高回收率可達到89.42%。而且從試驗結果中可以看到,梯度離心各組中20%作為上層明顯比30%上層得到的子孢子