FuGENE6（Roche）轉(zhuǎn)染步驟：轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分至培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)50-80％融合。將細(xì)胞以1-3X105/2ml接種于6孔板后孵育過(guò)夜將達(dá)到如此密度。將FuGENE6Reagent在室溫孵育10-15分鐘。使用之前將FuGENE6顛倒混勻一下。在PCR管中加入不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液以稀釋FuGENE6，直至總體積到100ul。將3-6ulFuGENE6Reagent直接加入營(yíng)養(yǎng)液，輕彈管壁混合。加入1-2ug的DNA溶液（0.02—2.0ug/ul）,輕彈管壁混合。室溫孵育20分鐘。將6孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，加入約1ml不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液洗滌一次，再加入2ml不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞，混勻使之均勻分布。3-8小時(shí)后，加入血清或換成含血清的營(yíng)養(yǎng)液。Lipofectamine2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染步驟（6孔板）：轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90-95％。細(xì)胞鋪板在2ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋4.0ugDNA，輕輕混勻。使用前將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用250ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋10ulLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine2000稀釋后，在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合（＜30分鐘）。NOTE：若使用DMEM培養(yǎng)基，則需在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine2000（第三步）。室溫放置20分鐘。（optional）將6孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入2ml無(wú)血清配養(yǎng)基。直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37°C,5%C0中保溫24-48小時(shí)。無(wú)需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。2或者在4-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長(zhǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后,分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色,檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類(lèi)型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá),在開(kāi)始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中,兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。貼壁細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞以$1:10的比例傳代至新鮮培養(yǎng)基中，次日加入選擇性培養(yǎng)基。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染步驟（24孔板）：轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（0.5-2X105）,細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90-95%。細(xì)胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋0.8-1.0ugDNA，輕輕混勻。使用前將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用50ul無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋1-3ulLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine2000稀釋后，在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合（＜30分鐘）。NOTE：若使用DMEM培養(yǎng)基，則需在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尩腄NA（第二步）和稀釋的Lipofectamine2000（第三步）。室溫放置20分鐘。（optional）將24孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入0.5ml無(wú)血清配養(yǎng)基。直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37C，5%CO中保溫24-48小時(shí)。無(wú)需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。2或者在4-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長(zhǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。55在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類(lèi)型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開(kāi)始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。貼壁細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞以$1:10的比例傳代至新鮮培養(yǎng)基中，次日加入選擇性培養(yǎng)基。EffecteneTransfectionReagent（Qiagen）轉(zhuǎn)染步驟：以下步驟適用于在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。開(kāi)始時(shí)，每6孔培養(yǎng)板使用0.4ugDNA。盡管DNA的量看起來(lái)很少，但已足夠用于轉(zhuǎn)染。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染前一天，用5ml含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每6孔培養(yǎng)板含2-8X105的細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而定）。在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常37°C和5%CO2）。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)40-80％融合。轉(zhuǎn)染時(shí)，用DNA濃縮緩沖液（ECBuffer）稀釋1ugDNA至100ul總體積（DNA用pH7-8的TEBuffer溶解,DNA最低濃度：0.1ug/ul）。加入3.2ulEnhancer，渦旋1s以混合溶液。重要：請(qǐng)保持DNA與Enhancer比例恒定。注意：質(zhì)粒DNA的質(zhì)量會(huì)顯著影響幾個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性、以及對(duì)于結(jié)果的解釋。因此，只應(yīng)該使用最高純度的DNA。使用HiSpeed,QIAfilter和QIAGENPlasmidKits抽提純化的質(zhì)粒適合于大多數(shù)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。要獲得最好的重復(fù)性和最好的結(jié)果，我們推薦使用EndofreePlasmidKit,該試劑盒可以快速有效地在質(zhì)粒純化過(guò)程中去除細(xì)菌內(nèi)毒素，從而獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。室溫（15-25C）孵育2-5分鐘，離心（spindown）幾秒鐘以從管頂去除液滴。向DNA-Enhance混合液中加入10ulEffecteneTransfectionReagent,反復(fù)吸取5次或渦旋10秒鐘以混合。注意：沒(méi)必要一直把EffecteneReagent置于冰上。在室溫中放置10-15分鐘不會(huì)改變它的穩(wěn)定性。室溫下（15-25°C）孵育5-10分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。孵育過(guò)程中,從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液,用4mlPBS洗滌一次細(xì)胞。加入1.6ml新鮮培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）到細(xì)胞中。加入0.6ml培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復(fù)合物的EP管中。吸取兩次以混合,立即將轉(zhuǎn)染復(fù)合物drop-wise加入6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物分布均勻。將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間直至轉(zhuǎn)染基因表達(dá)。孵育時(shí)間和由所采用的實(shí)驗(yàn)和所使用的基因決定。Optional:大多數(shù)情況下,不需去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然而,如果觀察到細(xì)胞毒性，則需在轉(zhuǎn)染后6-18小時(shí)移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗滌一次細(xì)胞,然后加入5ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，進(jìn)一步試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染0-gal或cat報(bào)告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育24-48小時(shí)以使轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)最大化。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，將細(xì)胞以1:5~1:10傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。注意：我們推薦對(duì)每一細(xì)胞系和使用的抗生素建立一個(gè)致死曲線（劑量-反應(yīng)曲線）。但是一定要記住致死曲線受細(xì)胞密度的影響。以下步驟有時(shí)是必須的：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于它們正常的培養(yǎng)液（如：不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液），然后孵育1-2天，然后再加入選擇性培養(yǎng)液。SuperfectTransfectionReagent(Qiagen)轉(zhuǎn)染步驟：以下步驟適用于在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染前一天，用含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每6孔培養(yǎng)板含2-8X105的細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而定）。在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常37°C和5%CO2）。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)40-80％融合。轉(zhuǎn)染時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2ugDNA至100ul總體積（DNA用pH7-8的TEBuffer溶解，DNA最低濃度：0.1ug/ul）?；旌?，離心幾秒鐘以從管頂去除液滴。注意：質(zhì)粒DNA的質(zhì)量會(huì)顯著影響幾個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性、以及對(duì)于結(jié)果的解釋。因此，只應(yīng)該使用最高純度的DNA。使用HiSpeed,QIAfilter和QIAGENPlasmidKits抽提純化的質(zhì)粒適合于大多數(shù)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。要獲得最好的重復(fù)性和最好的結(jié)果，我們推薦使用EndofreePlasmidKit,該試劑盒可以快速有效地在質(zhì)粒純化過(guò)程中去除細(xì)菌內(nèi)毒素，從而獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。向DNA稀釋液中加入10ulSuperfectTransfectionReagent,反復(fù)吸取5次或渦旋10秒鐘以混合。注意：沒(méi)必要一直把SuperfectReagent置于冰上。在室溫中放置10-15分鐘不會(huì)改變它的穩(wěn)定性。室溫下（15-25C）孵育5-10分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。孵育過(guò)程中，從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液，用2mlPBS洗滌一次細(xì)胞。加入600ul培養(yǎng)液（包含血清和抗生素）至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復(fù)合物的EP管中。吹打兩次以混合，立即將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物分布均勻。將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育2-3小時(shí)。小心移除Superfect-DNA混合物，用2mlPBS洗滌3-4次細(xì)胞加入新鮮的正常培養(yǎng)基，孵育24-48小時(shí)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，進(jìn)一步試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染0-gal或cat報(bào)告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育24-4