果蠅及其雜交后代的dna多態(tài)性

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna的技術(shù)是sh和ju。在pcr技術(shù)的基礎(chǔ)上，提出了一種新的分子標(biāo)記技術(shù)。所使用的原料是隨機(jī)合成的，通常只含有10個堿性氨基酸。rad反應(yīng)的周期為40.50次，每個周期的復(fù)性溫度為36.0c，對于低于50.060.0c的一般pcr反應(yīng)溫度，在rad循環(huán)中，雙向模型的dna在94.0c下呈94.0，打開雙螺旋，成為鏈模型。然后在低溫（36.0c）條件下，將隨機(jī)參數(shù)結(jié)合起來，根據(jù)taqnad多聚酶的原理，將果肉置于5和3c的方向，完成dna復(fù)制（72.0）。重復(fù)10次后，單個dna序列可以增加105107倍。因此，rad技術(shù)可以放大模型中的微變化，提高遺傳突變分析的分辨率，檢測同一種資源的微變化。目前，rad方法廣泛應(yīng)用于群體遺傳類型的評價、動植物遺傳鏈的構(gòu)建、基因定位、各種特征的分析和標(biāo)記的選擇等。果蠅具有生活史短、繁殖率高、飼養(yǎng)簡便、突變性狀多等特點,是現(xiàn)代遺傳育種學(xué)研究的重要試驗材料,國內(nèi)外對其研究極為活躍,涉及的領(lǐng)域十分廣泛.通過果蠅近交系的建立,并測量分析近交過程中性狀的變化和近交系的DNA變異,可作為近交對畜禽經(jīng)濟(jì)性狀影響的模擬試驗,同時可為進(jìn)一步分析研究DNA分子標(biāo)記與畜禽質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀的關(guān)系提供參考材料.1材料和方法1.1材料表面1.2方法1.2.1封閉式交系培養(yǎng)方法1.2.2測量蒼蠅的性能1.2.3提取各組dna1.2.4pcr反應(yīng)產(chǎn)物RAPD反應(yīng)程序為:94.0℃預(yù)變性200s,然后94.0℃變性60s,36.0℃退火60s,72.0℃延伸120s,進(jìn)行45個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72.0℃延伸600s,4.0℃下保存.PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外透射儀下觀察,拍照.1.2.5聚類分析方法平均羽化成蟲數(shù)統(tǒng)計每個近交系每代從第1只果蠅羽化開始至1周內(nèi)的羽化成蟲數(shù),然后匯總10個近交系的資料計算每個品種每代的平均羽化成蟲數(shù).RAPD分析在20個隨機(jī)引物中,OPH1、OPH4、OPH5、OPH10、OPH11、OPH16號引物未擴(kuò)增出產(chǎn)物.對其它14種引物的譜帶特征分別進(jìn)行統(tǒng)計.相似系數(shù)的統(tǒng)計,按照公式Sxy=2×Nxy/(Nx+Ny)計算.其中,Sxy為x和y兩品種的相似系數(shù),Nxy為x和y品種共有的DNA條帶數(shù)目,Nx和Ny分別為x和y品種各自的DNA擴(kuò)增條帶數(shù)目.遺傳距離(D),按照公式D=1-Sxy計算,然后用類平均法進(jìn)行聚類分析.2結(jié)果與分析2.1公司附近的構(gòu)建2.1.1每個品種的近交程度2.1.2每個品種的平均體重和平均羥基產(chǎn)卵數(shù)近交對果蠅近交系消失的影響在各品種間也不一致,有些品種消失得快,有些品種消失得慢(表5).2.2遺傳距離和聚類分析對14種引物的譜帶特征分別進(jìn)行編碼統(tǒng)計,有條帶的為1,無條帶的為0,從而獲得14種引物對各品種果蠅的總條帶數(shù)目和共享條帶數(shù)目(表6);然后求得各品種(或系)間的遺傳距離(表7).根據(jù)遺傳距離,用類平均法進(jìn)行聚類分析,結(jié)果在D=0.300時,Cy2、Cy、W、yW聚為一類;Z、Pvg、eP聚為一類;Pr2、W2、聚為一類.而E2和Pyvg與它們之間遺傳距離較遠(yuǎn)(圖4).3討論2.13.24.3rapd擴(kuò)增帶的制備和近交系的建立所用果蠅均取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種系繁育的果蠅群中.用野生型(+2)北京紫眼(P2)、黃體(Y2)、美國紫眼(Pr2)、翹翅(Cy2)、殘翅(Vg2)、黑檀體(E2)、紫卷、裂翅、白眼(W2)等共10個果蠅品種為材料建立近交系;并用白眼(W2)、美國紫眼(Pr2)、翅(Cy2)、黑檀體(E)等4個近交系和它們的雜交后代,以及其它相關(guān)果蠅分析RAPD變異.用連續(xù)多代的全同胞交配(圖1)和父女交配(圖2)兩種近交方法建立近交系.每個品種每種方法各繁殖10個近交系.在近交過程中,用電子分析天平每代測量10只(5♂,5♀)果蠅的體重,計算近交系的每代平均體重.同時,統(tǒng)計每代果蠅1周內(nèi)的羽成蟲數(shù),作為繁殖率的指標(biāo).從每個試驗材料中隨機(jī)抽出20只果蠅,冷凍數(shù)秒鐘使果蠅僵死,放于玻璃勻漿器中加入300μlTEN液(10mMTris-HCl,10mMNa2EDTA,0.15MnaCl,pH8.0),在冰浴中充分研磨,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi),加入等體積的10%SDS振蕩10min,然后再加入1倍的飽和酚和氯仿(1:1)輕微振蕩10min,12000rpm離心5min,取水相,重復(fù)苯酚-氯仿抽提過程直至水相與有機(jī)相間無蛋白析出為止,最后取上清液,用2倍等體積的無水乙醇(含10%乙酸鈉)沉淀DNA,離心棄乙醇,70%乙醇洗滌2次,真空抽干,溶于100ulTE溶液中,保存于-20℃冰箱中待用.所用20種隨機(jī)引物購自頂國公司(表1),為10個堿基的寡聚核苷酸鏈.其反應(yīng)體系為:14.0μl雙蒸水,2.0μlRAPD緩沖液,1.0μl引物,1.0μl4×dNTP,1.0μlTaqDNA多聚酶,1.0ul模板DNA.果蠅平均體重每個品種每代繁殖10個近交系,每個近交系每代測量10只(5♂,5♀)果蠅體重,然后匯總10個近交系的所有資料計算每代的平均體重.每個品種均通過4代以上的全同胞交配和父女交配,達(dá)到了較高的近交程度(表2).各品種的平均體重和平均羽化成蟲數(shù)見表3和表4.從近交對果蠅性狀的影響情況來看,隨著近交程度的增加,果蠅的體重和羽化成蟲數(shù)降低,但近交對羽化成蟲數(shù)的影響大于對體重的影響,在不同品種和代間也有差異.當(dāng)近交系數(shù)達(dá)0.594以上(全同胞交配4代,父女交配5代以上)時,在全同胞交配的W2、+2、Pr2、E2和父女交配的+2、W2、Y2、Pr2等品種中出現(xiàn)了個體很小的果蠅.對白眼(W2)、美國紫眼(Pr2)、翅(Cy2)、黑檀體(E2)4個近交系,以及近交的紫卷(Z)、Cy、W、YW、Prg、ep、Pyvg等品種(或系)的RAPD分析,結(jié)果表明(圖3):RAPD擴(kuò)增帶從1-10條不等,不同品種或系間有特異的RAPD帶,有些同一條帶EB染色后的熒光強(qiáng)弱也不同(反映擴(kuò)增帶中片段拷貝數(shù)為差異),這些多態(tài)性完全可作為遺傳標(biāo)記,在動物遺傳育種中應(yīng)用.2.3rapd標(biāo)記多態(tài)性遺傳育種在4個近交系與它們的雜交后代間的RAPD帶中(圖3、圖5),多數(shù)帶為以下2種類型:①正反交子代與雙親均相同的帶;②正反交子代與單親共有的帶.但親代與子代間的RAPD帶也存在著質(zhì)和量的差異,在質(zhì)的差異上出現(xiàn)雙親中沒有而子代中有的新帶如引物OPH12的擴(kuò)增片段,和雙親或單親中有而子代中沒有的帶如引物OPH13的擴(kuò)增片段等兩種;在量的差別上主要表現(xiàn)為有的帶在雙親與子代中的拷貝數(shù)不同.這反映了雙親與雜交后代之間遺傳結(jié)構(gòu)的差異.近交會出現(xiàn)近交衰退,這是人所共知的事實,但近交衰退并不是近交的必然結(jié)果.從本試驗的近交對果蠅性狀表型的影響情況可見,近交衰退的強(qiáng)度、時間和速度在不同品種(或近交系)、個體、性狀間表現(xiàn)不一致,有些衰退嚴(yán)重,而有些衰退輕,具有明顯的多態(tài)性.因此,我們認(rèn)為近交作為一種育種方法,只要運(yùn)用得當(dāng),利是大于害的,在畜禽育種的某些特殊條件下,為了使基因純合,固定性狀,還是可以采用的.RAPD方法是一種新興的分子生物學(xué)方法,自1990年發(fā)明以來在生物學(xué)的不同領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用.從本研究看,RAPD標(biāo)記用于遺傳育種研究同其它標(biāo)記相比具有以下優(yōu)點:(1)隨機(jī)引物多.使用10bp的隨機(jī)引物理論上就有410個隨機(jī)引物供篩選,因此,RAPD標(biāo)記就不會出現(xiàn)像生化遺傳和細(xì)胞遺傳標(biāo)記那樣由于標(biāo)記少而無適合的標(biāo)記在生產(chǎn)中應(yīng)用的情況.(2)RAPD標(biāo)記費(fèi)用低,方法簡單.目前能夠產(chǎn)生DNA多態(tài)性的分子生物學(xué)方法,除了RAPD之外,還有RFLP、AFLP、SSR、DNAfp等方法.可是相比之下,另外的這些方法雖各有優(yōu)點,但均需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、成本較高,而RAPD方法是最為簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的.可以預(yù)言,隨著方法的進(jìn)一步簡化,儀器設(shè)備和試劑的國產(chǎn)化,RAPD方法定會在動物遺傳育種中發(fā)揮更大的作用.目前一般認(rèn)為,雜種一代基因組中包含父母本的細(xì)胞核基因和母本的細(xì)胞質(zhì)基因.RAPD標(biāo)記一般為顯性遺傳的顯性標(biāo)記,從理論上講,如果父本和母本的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物中有(或無)某一片段時,雜種一代的擴(kuò)增產(chǎn)物也應(yīng)該有(或無)該特定片段.在本研究中,果蠅4個近交系的雜種一代的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物大部分與雙親或親本之一無明顯差異,但引物OPH12擴(kuò)增出雙