米氮平對肝微粒體中p450酶亞型的影響

美國氮平是第一個雙抗抑郁機制的藥物。它促進了5-ht1受體在5-ht1下的5-羥色胺能的神經(jīng)傳輸，并顯示了抗抑郁作用。鑒于服用抗抑郁藥物的病人往往需要長期服藥,在服藥期間可能服用其它藥物,而其中的一些藥物對代謝酶的作用,可能導(dǎo)致其中一種藥物加快代謝速度或者代謝障礙,進而發(fā)生毒副作用或者導(dǎo)致藥物無效,因此研究米氮平的代謝作用機理對于臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。目前,有關(guān)米氮平代謝情況的研究國外已見報道,本文通過建立鼠肝微粒體的米氮平代謝產(chǎn)物的RP-HPLC測定法,對米氮平在不同誘導(dǎo)劑(包括米氮平)處理的鼠肝微粒體代謝進行研究。1體外代謝實驗1.1儀器與藥品WATERSMODEL590高效液相色譜儀;SHIMADZUSPD-10UV-VIS檢測器;BECKMANLE-80K低溫超速離心機;LXJ-Ⅱ型離心機。米氮平標準品,無錫華裕生物制藥有限公司提供;地西泮對照品、苯巴比妥、利福平為南京腦科醫(yī)院提供;NADP為Amresco產(chǎn)品;葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶均為Sigma公司產(chǎn)品;甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純;水為雙蒸水。1.2大鼠預(yù)處理SD大鼠24只,♂,體重200±20g,由中國藥科大學(xué)動物中心提供,動物合格證號:SCXK(蘇)2002-0018。隨機分為苯巴比妥組、利福平組、米氮平組和空白對照組。苯巴比妥,利福平均溶于0.5%CMC-Na,80mg·kg-1·d-1(i.g.),7d,米氮平溶于0.5%CMC-Na,1.5mg·kg-1·d-1(i.g.),7d?？瞻讓φ战M為0.5%CMC-Na(i.g.),7d。1.3鼠肝微粒體制備大鼠末次給藥8h后開始禁食,過夜,斷頭處死,放血,以冷生理鹽水由肝門靜脈沖洗肝中殘余血液。取出肝臟,稱重,用預(yù)先冷凍的0.15mol·L-1KCl-0.1mol·L-1PBS(pH7.4)洗凈,剪碎,勻漿,15000r·min-1,4℃離心30min,棄去上層脂質(zhì)后取上清液,55000r·min-1,4℃離心60min,取沉淀用含30%甘油的緩沖液0.15mol·L-1KCl-0.1mol·L-1PBS(pH7.4)重懸,-85℃保存?zhèn)溆谩？捡R司亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度。1.4體外代謝實驗取鼠肝微粒體,用新鮮配制的NADPH再生系統(tǒng)稀釋成約1g·L-1蛋白質(zhì)濃度的混懸液,加入米氮平溶液使終濃度為50μmol·L-1,混勻,加入NADP/NADPH的混合溶液(含NADP1mmol·L-1,葡萄糖-6-磷酸5mmol·L-1,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶2KU·L-1,MgCl210mmol·L-1,臨用時新鮮配制,并充分混勻),啟動反應(yīng),并開始計時,于37℃溫孵60min,加入相同體積的乙腈溶液終止反應(yīng),加100μl的內(nèi)標,加入100μl25%氨水,渦旋1min,加入5ml環(huán)己烷,渦旋3min,3500×g離心10min,移取有機層4.0ml,30℃水浴氮氣流吹干,加入流動相100μl溶解殘渣,取20μl進樣,測定米氮平的剩余量。1.5色譜條件色譜柱:LichrospherODS(150mm×4.6mm,5μm);流動相ue5fe甲醇-水(含10mmol·L-1NH4AC,5mmol·L-1SDS,pH3.5)62ue5fe38,流速1ml·min-1,紫外檢測波長307nm;進樣量20μl。內(nèi)標為112mg·L-1的地西泮乙腈溶液。1.6統(tǒng)計學(xué)處理試驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,組間比較經(jīng)方差齊性分析后進行t檢驗。2結(jié)果2.1nh4ac-sds色譜條件采用不同流動相比較結(jié)果,米氮平在甲醇-10mmol·L-1NH4AC,含5mmol·L-1SDS,pH3.5(62ue5fe38,V/V)中色譜峰形較好,柱較高,內(nèi)標與米氮平及其代謝產(chǎn)物之間有良好的分離度,且保留時間適中(圖1)。2.2米氮平的檢測取不同濃度米氮平溶液,加入到失活的鼠肝微粒體懸浮液中,使反應(yīng)液中米氮平的終濃度為0.075、0.377、1.88、3.77、37.7、188、377、565μmol·L-1,以米氮平的濃度為橫坐標,米氮平與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標,計算曲線的回歸方程,y=0.0128x-0.0305(r=0.9996,n=5)。米氮平在0.075～565μmol·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。測得檢測限(S/N=3)為0.0377μmol·L-1。2.3方法回收率、日內(nèi)精密度與最終精密度分別于失活的鼠肝微粒體中準確加入0.075、3.77、565μmol·L-1的米氮平,測得方法回收率、日內(nèi)精密度與日間精密度如下表。測得方法回收率分別為92.8%(RSD3.8%)、94.7%(RSD3.8%)、98.0%(RSD1.4%,n=5)。日內(nèi)精密度分別為9.2%、4.3%、4.3%;日間精密度7.6%、3.4%、1.3%(n=5)。2.4米氮平和苯巴比妥組的vm,km計算在不同預(yù)處理鼠肝微粒體溫孵液中分別加入米氮平標準液,使米氮平濃度分別為5、10、20、30、50、100、200、300μmol·L-1,按“1.4”項下方法操作。根據(jù)Lineweaver-Burk方程式,以1/[S]-1/[V]進行線性回歸。苯巴比妥組:y=1.7161x+0.0052(r=0.9880,n=3);利福平組:y=1.6488x+0.0082(r=0.991,n=3);米氮平組:y=1.8125x+0.0106(r=0.995,n=3);空白對照組:y=1.8995x+0.0086(r=0.999,n=3)。據(jù)米氏方程計算米氮平在四組鼠肝微粒體Vm,Km值,經(jīng)過t檢驗(P<0.01),苯巴比妥組比對照組高,而米氮平組和利福平組與對照組比較均無顯著差異(表1,圖2)。同時以Scatchard作圖法對不同底物濃度的代謝結(jié)果進行比較(圖3),在此作圖法中υ-υ/[S]不在一條直線上,表明米氮平的代謝可能不止一種酶的催化。2.5鼠肝微粒體的代謝米氮平在不同預(yù)處理的鼠肝微粒體中溫孵60min后在苯巴比妥誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中代謝速度明顯大于對照組及米氮平誘導(dǎo)組鼠肝微粒體組,利福平組次之。苯巴比妥組64.37%的量被代謝,利福平組54.07%的量被代謝,米氮平組35.78%的量被代謝,對照組37.87%的量被代謝。經(jīng)過t檢驗,苯巴比妥組和利福平組與空白組比較均有顯著性差異,而米氮平組與對照組比較無顯著性差異(表2)。2.6穩(wěn)定性微粒體孵化取苯巴比妥誘導(dǎo)的鼠肝微粒體和空白微粒體適量,用NADPH再生系統(tǒng)稀釋成約1g·L-1的蛋白質(zhì)懸浮液后,加入米氮平適量,使終濃度為50μmol·L-1(C0),分別于溫孵0、10、20、30、40、60、80、100min后取樣測定剩余濃度(Ct)。以lgc0/ct-t回歸,得苯巴比妥組:lgc0/ct=0.0042t+0.0445(r=0.979),空白對照組lgc0/ct=0.0012t+0.0176(r=0.950)。表明米氮平在兩種微粒體孵育液中的反應(yīng)屬于一級反應(yīng),反應(yīng)速率常數(shù)(K1)分別為:苯巴比妥組0.0097,空白對照組0.0028;半衰期(t1/2)分別為:苯巴比妥組61.1min,空白對照組236.2min。米氮平反應(yīng)濃度與時間曲線見圖4。3米氮平及其代謝目前,國外對米氮平的研究已有一些報導(dǎo),主要使用基因表達產(chǎn)物以及不同P450酶亞型的探針藥物研究米氮平經(jīng)何種酶代謝,但是對于米氮平長期誘導(dǎo)之后是否會影響肝藥酶活性及在肝微粒體中起何種代謝動力學(xué)特征未見報導(dǎo),且國內(nèi)外尚未見通過高效液相-紫外檢測法同時分離測定米氮平及其代謝物的方法報道。本試驗中采用25%氨水堿化后環(huán)己烷提取的方法處理樣品,并在流動相中添加離子對試劑SDS、調(diào)節(jié)pH,RP-HPLC-UV檢測,使樣品中的米氮平及其代謝物在上得到良好的分離,以上試劑及儀器均簡單易得,且成本較低。本文首次通過米氮平誘導(dǎo)鼠肝微粒體,研究米氮平對介導(dǎo)其自身代謝的P450酶亞型是否有影響。根據(jù)米氮平誘導(dǎo)組與對照組無顯著差異這一現(xiàn)象,認為米氮平對介導(dǎo)其代謝的P450酶亞型無明顯的誘導(dǎo)或者抑制作用。表明米氮平對于米氮平自身的代謝無催化或抑止作用,這提示長期服用米氮平產(chǎn)生明顯耐受性或者毒副作用的可能性比較小。本文首次對米氮平在肝微粒體中的代謝時間曲線進行了研究,預(yù)測米氮平在肝微粒體中代謝為一級反應(yīng)。采用Lineweaver-Burke和Scatchard作圖法對不同底物濃度的代謝結(jié)果進行比較,在Scatc