白芍總苷對糖尿病大鼠腎小管-間質(zhì)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

結(jié)果表明，人類糖尿病腎病（dn）的腎小管間質(zhì)損傷程度與系膜擴(kuò)張、腎小管過濾率和尿道數(shù)呈正相關(guān)。近年來,研究表明糖尿病腎小管-間質(zhì)損傷與氧化應(yīng)激、炎癥及腎小管-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)。白芍總苷(totalglucosidesofpaeony,TGP)是我國中藥白芍根中提取成分,主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分,其藥理作用有抗炎、抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性。我們以前的研究表明TGP可明顯減輕糖尿病大鼠尿白蛋白排泄,抑制腎組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)蛋白Ⅳ型膠原的產(chǎn)生。本研究進(jìn)一步觀察了TGP對糖尿病大鼠腎小管-間質(zhì)損傷的保護(hù)作用,并探討其機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物中心提供g50只昆明種SD♂大鼠(體重180～200g,安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)。在室溫(22±1)℃、相對濕度55%±5%、光照周期12～12h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1wk后實(shí)驗(yàn)。1.1.2特效藥TGP:安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所魏偉教授惠贈,用前溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中。1.1.3單克隆抗體ssoc鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):Sigma公司產(chǎn)品,臨用前溶解在0.01mol·L-1枸椽酸緩沖液中,pH4.5;免抗大鼠Osteopontin(OPN)與α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)多克隆抗體系SantaCruza公司產(chǎn)品;小鼠抗大鼠硝基酪氨酸(Nitrotyrosine,NT)單克隆抗體系Upstate公司產(chǎn)品;生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG及鏈酶親和素-生物素復(fù)合物(SABC)購自武漢博士德公司;硝酸纖維膜購自美國Amersham公司;ECL發(fā)光試劑購自Pierce公司。1.2方法1.2.1血糖、血糖測定大鼠腹腔一次性注射STZ65mg·kg-1,48～72h后尾靜脈采血,應(yīng)用血糖儀測定血糖,血糖16.7mmol·L-1以上確定為糖尿病大鼠,對照組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。1.2.2灌胃給藥及劑量溶媒給藥大鼠隨機(jī)分:對照組(n=10)、模型組(n=10)、TGP給藥組(n=30)。選擇50、100、200mg·kg-1·d-1TGP灌胃給藥,對照組和糖尿病組給予等量溶媒。所有大鼠在整個實(shí)驗(yàn)期間喂標(biāo)準(zhǔn)飲食,自由飲水,不應(yīng)用胰島素,觀察8wk。1.2.3腎組織pas染色在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側(cè)頸總動脈插管收集血標(biāo)本,4℃離心取血漿保存于-20℃待測血糖水平。然后通過右側(cè)頸總動脈插管注入4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟,至整個腎臟顏色變蒼白后游離,置于冰上,取8mm3大小腎組織置于4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋,厚2μm切片,行PAS染色。同時制4μm多聚賴氨酸處理切片,進(jìn)行免疫組化研究。剩余腎組織分別切成小塊,置于液氮中,凍透后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中待行Westernblot檢測。1.2.4腎-間質(zhì)面積PAS染色切片高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇30個腎小管-間質(zhì)視野(無腎小球與血管),應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)軟件(北京航空航天大學(xué))測定腎小管-間質(zhì)面積。所測腎小管-間質(zhì)面積按以下標(biāo)準(zhǔn)評分:0:正常;1:間質(zhì)炎癥與纖維化、腎小管萎縮與擴(kuò)張伴管型形成<25%所測區(qū)域;2:損傷面積在25%～50%所測區(qū)域;3:損傷面積>50%所測區(qū)域。腎小管-間質(zhì)損傷指數(shù)(indicesfortubulointerstitialinjury,TII)為以上各積分中位數(shù)。1.2.5免疫組化染色切片常規(guī)脫蠟,用3%H2O2甲醇封閉內(nèi)源性過氧化酶,應(yīng)用微波爐暴露抗原后,血清封閉內(nèi)源性生物素。加兔抗大鼠OPN(1∶200)、α-SMA(1∶100)多克隆抗體,4℃過夜,再加生物素化羊抗兔IgG(1∶200),室溫30min,滴加SABC,室溫30min,滴加DAB顯色液,鏡下控制著色時間。實(shí)驗(yàn)采用刪除第一抗體作陰性對照。陽性物質(zhì)呈棕色顆粒狀,腎小管-間質(zhì)免疫組化判斷應(yīng)用圖像分析系統(tǒng),計算其陽性面積占腎小管-間質(zhì)面積百分比(%),取均值進(jìn)行比較。1.2.6sds-東南角電泳mg腎組織置入裂解液(0.1mol·L-1NaCl,100mmol·L-1Tris-HCl,10mmol·L-1EDTA,100mg·L-1PMSF,2mg·L-1Leupeptin)0.25ml勻漿,4℃12000×g離心2min,取上清液測蛋白濃度。取30μg蛋白煮沸5min后,經(jīng)15%SDS電泳,電轉(zhuǎn)移至NC膜上,在5%脫脂奶粉-PBST溶液室溫下封閉2h,加入小鼠抗大鼠NT(1∶5000)4℃過夜,洗膜后再用HRP標(biāo)記的二抗雜交,37℃,1h。洗膜后在暗室中加ECL發(fā)光試劑,X光膠片曝光1～2min后顯影、定影。雜交信號在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用管家基因α-actin作為蛋白上樣量對照,其余組與其相比得到相對量,取均值。1.2.7非正態(tài)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以xˉ±sxˉ±s表示,TII半定量評分為非正態(tài)分布資料,采用中位數(shù)表示。應(yīng)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,參數(shù)資料采用One-WayANOVA檢驗(yàn),非參數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。2tgp對大鼠tii的影響模型組大鼠表現(xiàn)為血糖升高、體重下降、相對腎重(腎重/體重)增加,TGP50、100、200mg·kg-1,給藥8wk沒有防止模型組大鼠血糖升高與體重下降。TGP(50、100、200mg·kg-1)給藥組大鼠相對腎重與模型組相比有所下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Tab1)。模型組大鼠TII明顯高于對照組,提示本模型大鼠已出現(xiàn)腎小管-間質(zhì)損害;TGP50mg·kg-1給藥組大鼠TII較模型組有所下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,TGP100、200mg·kg-1給藥組TII均明顯低于模型組(Tab2,Fig1)。免疫組化顯示對照組大鼠腎小管-間質(zhì)有微弱OPN蛋白表達(dá),模型組腎小管-間質(zhì)OPN蛋白表達(dá)明顯高于對照組(9.82%±1.46%比0.72%±0.09%,P<0.01),TGP100、200mg·kg-1給藥組腎小管-間質(zhì)OPN蛋白表達(dá)明顯低于模型組(5.56%±0.53%、2.99%±0.35%比9.82%±1.46%,P<0.01,Fig2)。Westernblot條帶光密度分析顯示模型組腎組織NT蛋白表達(dá)較對照組增加3.4倍,TGP50、100、200mg·kg-1給藥8wk可使腎組織NT蛋白表達(dá)分別下降41.2%、43.8%與57.5%(Fig3)。免疫組化顯示對照組大鼠腎小管-間質(zhì)有微弱α-SMA蛋白表達(dá),模型組腎小管-間質(zhì)α-SMA蛋白表達(dá)明顯高于對照組(9.60%±0.97%比0.42%±0.07%,P<0.01),TGP50、100、200mg·kg-1給藥組腎小管-間質(zhì)α-SMA蛋白表達(dá)明顯低于模型組(2.67%±0.21%、1.52%±0.24%、0.91%±0.13%比9.60%±0.97%,P<0.01,Fig4)。3tgp對糖尿病腎組織opn表達(dá)的影響DN腎小管-間質(zhì)損傷早期腎小管上皮細(xì)胞肥大、基底膜增厚及間質(zhì)容量擴(kuò)大是晚期腎小管萎縮與間質(zhì)纖維化的前驅(qū)。目前眾多臨床研究表明,DN腎小管-間質(zhì)纖維化程度與腎功能損害呈正相關(guān),是DN預(yù)后不良的主要病理指標(biāo)之一。因此,加強(qiáng)DN腎小管-間質(zhì)損傷的發(fā)病機(jī)制及防治的研究具有重要的臨床意義。本研究表明糖尿病大鼠腎小管-間質(zhì)損傷指數(shù)明顯增加,TGP可明顯減輕糖尿病腎小管-間質(zhì)損傷,提示TGP對腎小管-間質(zhì)損傷有明顯保護(hù)作用,我們進(jìn)一步探討了TGP對糖尿病腎小管-間質(zhì)損傷的保護(hù)作用機(jī)制。近年來,隨著對DN腎小管-間質(zhì)損傷的研究深入,發(fā)現(xiàn)炎癥在腎小管-間質(zhì)損傷中起重要作用,在DN早期不僅腎小球有大量巨噬細(xì)胞浸潤,腎小管-間質(zhì)也有大量巨噬細(xì)胞浸潤,浸潤至腎組織的巨噬細(xì)胞并不是對糖尿病腎臟損害單純反應(yīng),而是主動參與者,它可釋放多種炎癥介質(zhì)、生長因子與氧反應(yīng)產(chǎn)物(reactiveoxygenspecies,ROS)如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、一氧化氮(NO)、血小板衍化生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)及轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等促進(jìn)腎臟炎癥、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生、ECM合成及上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。巨噬細(xì)胞浸潤至糖尿病腎組織涉及到選擇素、整合素、化學(xué)介質(zhì)及細(xì)胞黏附因子的相互作用。不同的化學(xué)介質(zhì)趨化巨噬細(xì)胞進(jìn)入腎組織不同的部位,OPN是一種含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序的分泌型磷酸化糖蛋白,體內(nèi)外研究顯示由于巨噬細(xì)胞細(xì)胞對OPN的趨化作用,使其向腎小管-間質(zhì)浸潤,應(yīng)用OPN中和性抗體或OPN基因敲除小鼠腎小管-間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤明顯減少。我們現(xiàn)在的研究表明TGP100,200mg·kg-1給藥可明顯降低腎小管-間質(zhì)OPN表達(dá),提示TGP可能減輕糖尿病腎小管-間質(zhì)炎癥損傷。TGP對糖尿病腎小管-間質(zhì)OPN表達(dá)影響的機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報道。TGP是我國傳統(tǒng)中藥,近年來體內(nèi)外研究提示TGP具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面的作用。最近,研究表明糖尿病腎組織OPN表達(dá)與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過度激活有關(guān)。而NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過度激活與糖尿病環(huán)境下腎組織氧化應(yīng)激增加有關(guān)。糖尿病時產(chǎn)生過多ROS和NO快速反應(yīng)生成ONOO-,ONOO-是過氧化亞硝酸鹽,不僅代表氧化應(yīng)激水平的升高,也是強(qiáng)氧化劑。本實(shí)驗(yàn)通過檢測ONOO-的特異性標(biāo)志物NT在腎臟的表達(dá),結(jié)果顯示DN組NT表達(dá)較對照組明顯升高,TGP給藥組呈劑量依賴性抑制糖尿病腎組織NT表達(dá),提示TGP對糖尿病腎組織氧化應(yīng)激增加有明顯抑制作用。因而,TGP對腎組織OPN表達(dá)的抑制作用可能部分與其抗氧化作用有關(guān)。另外,在體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞中加入TGFβ1可誘導(dǎo)OPN表達(dá),我們以前的研究表明TGP可明顯抑制糖尿病腎組織TGFβ1,因而,TGP抑制TGFβ1表達(dá)也可能促進(jìn)了OPN表達(dá)的下降。DN腎小管-間質(zhì)損傷早期腎小管基底膜增厚,主要與ECM合成增加、降解減少有關(guān),DN發(fā)生、發(fā)展過程中多種病理因素可使腎小管-間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生表型改變,開始表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物如α-SMA并分泌ECM,TGFβ1被認(rèn)為參與這一過程并在其中起著十分關(guān)鍵的作用,其中腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化可能是DN發(fā)生間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一,抑制轉(zhuǎn)分化對控制DN病理損害起重要作用。我們的研究也表明TGP50、100、200mg·kg-1給藥8wk劑量依賴性地使腎小