第一節(jié)基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)第二節(jié)基因工程大腸桿菌的構建技術第三節(jié)基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第十四章基因工程制藥工藝獲得目的基因組建重組質粒構建工程菌（或細胞）培養(yǎng)工程菌產物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝第一節(jié)基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)14.1.1大腸桿菌表達系統(tǒng)14.1.

2酵母表達系統(tǒng)基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)基因工程菌：以微生物為操作對象，通過基因工程技術獲得的表達外源基因，過量或抑制表達自身基因的工程生物體。種類：大腸桿菌和酵母是重要的表達重組藥物的制藥生物。主要是生產重組蛋白質類藥物細胞：G－，單細胞，桿狀。鞭毛、無芽孢、一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2－3mm。1、大腸桿菌形態(tài)特征14.1.1大腸桿菌表達系統(tǒng)基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)

能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產氣產酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕-12株的衍生菌株?；蚪M：4.6Mb，3000多種蛋白質。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質為質粒。2、生化與遺傳特性基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3、質粒載體復制子選擇標記多克隆位點基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)首字母：大寫：細菌屬名2-3字母：小寫：細菌種名如EcoR14:大寫:菌株

1，2…:分離到酶的次序質粒載體的基本特征自主復制性：復制子：復制起始點及控制復制頻率的調控元件。質粒不依賴于染色體DNA而自主復制選擇性標記：質粒編碼的選擇標記，產生一種新的表型，用于轉化體的篩選?？股乜剐曰颍逼S、四環(huán)素、卡那霉素等多克隆位點：是外源基因插入載體的位置，有多種常見的限制性內切酶位點序列構成不相容性：具有相同或相似復制子結構及特征的兩種不同質粒不能穩(wěn)定地存在于同一宿主細胞內轉移性：從一個宿主細胞轉移到另一個宿主細胞/菌。基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)質粒類型嚴緊型質粒：在每個宿主細胞只能復制少數幾個拷貝的質粒，pSC101松弛型質粒：在每個細胞中能復制幾十至幾百個拷貝數的質粒，pMB1和colE1?？寺≠|粒：用于克隆和擴增外源基因。測序質粒：用于基因測序。整合質粒：用于外源基因與宿主染色體整合。穿梭質粒：能在兩種宿主細胞存在。表達質粒：能表達基因產物基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)4、產物表達形式不溶性蛋白質：細胞質內形成包涵體可溶性蛋白質：存在于細胞質周質表達:外源蛋白被運輸分泌到周質，可溶性。有利于分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表達：胞內可溶性蛋白質分泌到胞外的培養(yǎng)液中。基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。大腸桿菌中目標產物的表達水平過高，超過正常代謝水平，過多表達產物聚集在細胞內，形成不溶性的包涵體。①蛋白過量積聚，超過溶解度，導致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內部二硫鍵的錯誤連接導致沉淀；④表達蛋白過多，與其結合/誘導組分不足，不能形成溶解狀態(tài)⑤蛋白質自身不穩(wěn)定。5、優(yōu)缺點發(fā)展最早、應用最廣泛的經典的表達系統(tǒng)。具有遺傳背景清楚、目標基因表達水平高（高達70％），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強。不能用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達。細胞死亡后，細胞壁脂多糖游離出來，形成內毒素，具有抗原性，產生熱源。

N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應。基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)6、應用大量外源基因能超量的表達，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素(1種PEG化)

細胞因子類：5種干擾素α、干擾素β和γ，2種G-CSF，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：r-PA

白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)14.1.

2酵母表達系統(tǒng)1、形態(tài)特征細胞：單細胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊?；蚬こ讨扑幬⑸锉磉_系統(tǒng)2、生長與遺傳特征孢子萌發(fā)產生單倍體細胞，兩個性別不同的單倍體細胞結合形成二倍體接合子或營養(yǎng)細胞，進行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景已相當清楚?；蚪M：120.68Mb，5887個ORF，編碼約6000個基因基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3、表達載體含有復制起始序列或整合序列、選擇標記以及由啟動、終止子和信號肽序列構成的表達盒序列。四種類型：YIp酵母整合載體YCp酵母著絲粒載體YRp酵母復制載體YEp酵母附加載體

基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)4、優(yōu)缺點優(yōu)點：五種類型的載體，——安全、無毒。營養(yǎng)缺陷選擇外來質粒。培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術成熟。亞細胞器分化，進行蛋白質的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質分泌能力。缺點：釀酒酵母發(fā)酵產生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質糖基化側鏈過長，會引起副作用?；蚬こ讨扑幬⑸锉磉_系統(tǒng)5、應用

1981年Hitzman等：酵母表達人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素細胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長因子多肽類：高血糖素

2種乙肝疫苗等。

8種產品基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)第一節(jié)基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)第二節(jié)基因工程大腸桿菌的構建技術第三節(jié)基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第十四章基因工程制藥工藝基因工程制藥基因工程技術-基因重組示意圖DNA片段酶切、連接，形成重組DNA分子導入宿主細胞系統(tǒng)中擴增目標基因表達，生成新產物，出現新性狀。大腸桿菌的構建技術第二節(jié)基因工程大腸桿菌的構建技術14.2.1構建流程14.2.

2目標基因的克隆14.2.

3表達載體構建14.2.

4工程菌構建基因工程制藥大腸桿菌的構建技術14.2.1構建流程目標基因克隆研究內容研究方法PCR，文庫，化學合成表達載體構建遺傳轉化與篩選工程菌酶切，連接外源基因導入與培養(yǎng)新性狀、功能、物質基因工程制藥大腸桿菌的構建技術14.2.

2目標基因的克隆目標基因：是編碼目標蛋白質或多肽的DNA序列。正確克隆的重要性：只要有一個堿基發(fā)生突變，就導致編碼氨基酸的變化，影響產物蛋白質的功能和生物學的活性。基因工程制藥大腸桿菌的構建技術RT-PCR克隆目標基因流程反轉錄：起始原料RNAPCR：起始原料DNA基因工程制藥大腸桿菌的構建技術反轉錄反應的操作樣品變性：75℃水浴5min，冰冷，引物與mRNA配對反轉錄：反轉錄酶42℃或37℃，cDNA第一鏈，1h終止反應：使反轉錄酶失活，95℃加熱5min反轉錄酶：RNA依賴的DNA聚合酶，以RNA為模板，dNTP為底物，以DNA為引物，合成與RNA互補的DNA基因工程制藥大腸桿菌的構建技術引物引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內引物長度一般在15~30堿基之間引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃引物3′端要避開密碼子的第3位引物自身及引物之間不應存在互補序列引物，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的?；蚬こ讨扑幋竽c桿菌的構建技術1、PCR擴增（1）PCR技術

PCR(Polymerasechainreaction)

聚合酶鏈式反應：在DNA聚合酶催化下，對特定的DNA序列進行的復制反應本質：生物體DNA復制原理在體外合成DNA

發(fā)明者：Mullis，生物技術革命的象征，1993年獲得諾貝爾獎基因工程制藥大腸桿菌的構建技術在引物的指導下，以DNA為模板，由DNA聚合酶催化的擴增特定DNA序列的聚合延伸形成互補序列的反應5′—3′聚合反應PCR基因工程制藥大腸桿菌的構建技術基因工程制藥大腸桿菌的構建技術變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C（2）PCR單反應原理與過程打開雙鏈，形成單鏈引物與模板結合形成新的雙鏈（2）PCR單反應原理與過程(1)變性(94℃)(2)退火(55℃)(4)完成一個循環(huán)(3)延伸(72℃)基因工程制藥大腸桿菌的構建技術（3）PCR循環(huán)基因工程制藥大腸桿菌的構建技術（4）PCR擴增反應體系組成成分濃度用量作用緩沖液10×5mL提供反應環(huán)境dNTPs20mmol/L1mL反應的底物正向引物20mmol/L2.5mL擴增的起始點反向引物20mmol/L2.5mL擴增的終止點DNA聚合酶1～5U/mL1～2mL催化，熱穩(wěn)定MgCl21～5mmol/L1mL輔酶模板DNA5～10mL含目標基因序列H2O27～33mL稀釋總體積50mL基因工程制藥大腸桿菌的構建技術（5）PCR擴增產物反應變性退火聚合循環(huán)數第一個反應94℃，5min1第二個反應94℃，30s55℃，30s72℃，1min30-35第三個反應94℃，1min55℃，30s94℃，7-10min1基因工程制藥大腸桿菌的構建技術概念：在特異位點上催化dsDNA分子的斷裂，產生相應的限制性片段。酶切體系組成：目標和質粒DNA，緩沖液，限制性內切酶。反應條件：適宜溫度(37℃)，1小時以上。終止反應：加熱；加入EDTA，螯合鎂離子。電泳檢查：酶切完全性。2、酶切反應基因工程制藥大腸桿菌的構建技術粘性末端平頭末端基因工程制藥大腸桿菌的構建技術3、連接反應概念：

DNA雙鏈上相鄰的3′-羥基和5′-磷酸基因共價結合形成3′-5′-磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶。連接反應：16℃-26℃，數小時，或過夜。終止反應：在70℃加熱10分鐘?；蚬こ讨扑幋竽c桿菌的構建技術基因工程制藥大腸桿菌的構建技術4、轉化轉化：把外源基因導入宿主細胞的過程；某一基因型細胞從周圍介質中吸收另一基因型細胞的DNA，使其基因型和表型發(fā)生相應變化的現象基因工程制藥大腸桿菌的構建技術大腸桿菌轉化——CaCl2法感受態(tài)細胞制備：將培養(yǎng)液轉入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下離心10分鐘。棄去上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2

溶液10ml輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30分鐘后，4℃下，離心10分鐘。加入連接反應產物：混勻，置冰上30分鐘。熱擊：42℃，90s；置冰上，1－2分鐘。擴增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37℃，45分鐘。涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)：37℃，出現菌落?；蚬こ讨扑幋竽c桿菌的構建技術

感受態(tài)細胞制備：E.coli經Cacl2處理（0～5℃），使細胞膜通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力。5、篩選與鑒定非轉化子：沒有導入外源DNA的非轉化宿主細胞轉化子：導入外源DNA的轉化細胞非重組子：僅含有空載體分子的轉化子重組子：含有重組DNA分子的轉化子目標重組子：含有連接正確的重組分子（目的）非目標重組子：不含目的基因重組子轉化后的細胞類型基因工程制藥大腸桿菌的構建技術（1）篩選方法抗生素篩選法：抗生素的抗性基因，氨芐青霉素。基因工程制藥大腸桿菌的構建技術（1）篩選方法基因工程制藥大腸桿菌的構建技術培養(yǎng)基中含X-galX-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷β

-半乳糖苷酶可以把培養(yǎng)基中無色的X-gal分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4-氯-靛藍，使菌落成藍色抗生素篩選法：籃白斑篩選法：lacZ基因，重組子白色，非重組子藍色。（1）篩選方法基因工程制藥大腸桿菌的構建技術若LacZ基因被外源DNA插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為無色（白色）。（2）鑒定方法菌落PCR：含有目標基因載體大?。弘娪緳z測酶切鑒定：目標基因插入及插入方向測序確證：目標基因的序列準確無誤基因工程制藥大腸桿菌的構建技術14.2.

3表達載體構建表達載體概念：在質粒載體的基礎上，在多克隆位點處插入外源基因表達盒所構成。外源基因表達盒(操縱子模型)：目標基因啟動