基因擴(kuò)增檢驗(yàn)專業(yè)現(xiàn)場評審方法和技巧醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室評審員繼續(xù)培訓(xùn)/評審組長同級轉(zhuǎn)換培訓(xùn)班上海2021-4-25~26.現(xiàn)場評審的根本思緒基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均經(jīng)過衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的技術(shù)驗(yàn)收，驗(yàn)收規(guī)范又根本參照了ISO15189認(rèn)可準(zhǔn)那么的要求，所以，在評審預(yù)備要實(shí)驗(yàn)室提供驗(yàn)收合格證書日程安排上不能因經(jīng)過了技術(shù)驗(yàn)收而忽視了PCR實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可重點(diǎn)關(guān)注懇求的工程能否都有批文、各項(xiàng)記錄能否完善等內(nèi)容.常見不符合項(xiàng)舉例及分析HBV-DNA可報告范圍為103－108，HCV-RNA可報告范圍為103－107，規(guī)范曲線和室內(nèi)質(zhì)控的濃度設(shè)定都在104以上，建議察看103低濃度值。有一位從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)任務(wù)人員未獲得培訓(xùn)合格證書.分區(qū).現(xiàn)場評審的重要環(huán)節(jié)檢驗(yàn)前程序〔PCR技術(shù)驗(yàn)收表6－－標(biāo)本管理〕－－驗(yàn)收表比較簡單，應(yīng)留意RNA、分泌物等標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和保管檢驗(yàn)程序〔見后〕檢驗(yàn)后程序〔留意TAT能否滿足質(zhì)量目的的要求；報告單所必需包含的內(nèi)容〕座談會〔要了解臨床對定量HBV-DNA；性病檢測〕.DNA、RNA的保管DNA標(biāo)本無菌條件2-8℃保管不超越3天，超越3天-20℃。標(biāo)本長期保管應(yīng)在-70℃。防止多次反復(fù)凍融。DNA在TE緩沖液中〔10mmol/LTris-Hcl，1mmol/LEDTA，PH8.0〕，4℃儲存6個月以上，其中EDTA還可抑制微生物生長。RNA容易降解，操作和儲存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高壓滅菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯〔DEPC〕處置過的蒸餾水溶解RNA，RNA溶液中參與RNA酶抑制劑〔RNasin〕，終濃度為2U/10μl，置-20℃保管備用。冰塊上操作為宜。.其他標(biāo)本棉拭子－－生理鹽水充分振蕩洗滌、靜置5～10min、取上清、離心、沉淀物提DNA。如不立刻提取，存－70℃膿液－－沉淀標(biāo)本的保管同樣為－70℃體液－－沉淀標(biāo)本的保管同上.

檢測系統(tǒng)

校準(zhǔn)〔加樣器、溫濕度計(jì)、擴(kuò)增儀〕－查看文件與實(shí)踐校準(zhǔn)的情況頻度：初次〔新安裝〕；后續(xù)〔主要部件維修，強(qiáng)迫周期如每年，不定期〕PCR儀：溫度準(zhǔn)確度及升降速率；熒光本底；激發(fā)及吸收波長的準(zhǔn)確度、雜閃光、反復(fù)性、線性.檢測系統(tǒng)比對－－沒有開展室間質(zhì)評的工程；比對的結(jié)果性能驗(yàn)證－－新啟用的設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)－－保養(yǎng)程序、操作手冊嚴(yán)厲按照儀器運(yùn)用手冊編寫，包括日、周、月、季、半年、年－－標(biāo)識〔時間、稱號〕－－記錄.現(xiàn)場評審的關(guān)注點(diǎn)檢測系統(tǒng)室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)評溯源及丈量不確定度現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)人員才干檢驗(yàn)前程序察看檢驗(yàn)報告生物平安座談會.室內(nèi)質(zhì)控

采用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法延續(xù)地評價檢測任務(wù)的可靠程度，判別檢驗(yàn)報告能否可以發(fā)出的過程目的是控制本實(shí)驗(yàn)室測定任務(wù)的精細(xì)度，監(jiān)測其準(zhǔn)確度的改動，提高常規(guī)檢驗(yàn)任務(wù)的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性室內(nèi)質(zhì)控規(guī)那么的制定能否合理〔質(zhì)控圖、質(zhì)控程度、質(zhì)控頻率〕－－每次現(xiàn)場驗(yàn)收問題最多的地方.室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控目的：假陰性、假陽性，準(zhǔn)確性、精細(xì)度質(zhì)控點(diǎn)：樣本質(zhì)量、模板提取、擴(kuò)增效率質(zhì)控物安排：空白、陰對、弱陽對、規(guī)范品控制范圍：空白、陰對-------陰性弱陽對-------陽性〔上下一次方〕規(guī)范品-------r值〔-0.998〕斜率〔-3.1----3.5〕截距〔﹥40左右；達(dá)安﹥30〕點(diǎn)間CT值〔3.3左右〕.如何確定閾值基線的作用〔Baselinecycles〕消除檢測中背景熒光信號的影響，確定閾值基線的范圍：儀器普通默許的范圍〔應(yīng)根據(jù)試劑合要求〕PE-5700、PE-70003-15iCycle2-10LightCycle3-12基線需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展適當(dāng)調(diào)整：延伸基線以包括最高濃度樣本擴(kuò)增曲線起跳前盡能夠多的循環(huán)，可以使擴(kuò)增曲線更平滑、數(shù)據(jù)也得到一定改善。

..閾值線熒光閾值線的調(diào)整需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展適當(dāng)調(diào)整1、落在陰性對照線最高點(diǎn)上方2、外規(guī)范擴(kuò)增曲線的均一位置〔點(diǎn)間CT3.3左右〕3、盡量接近擴(kuò)增曲線剛真正進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的位置〔防止弱陽性漏檢以及一些擴(kuò)增反響影響要素在指數(shù)期的放大〕.ThresholdCycleCalculation:BaselinecyclesThroughThresholdPosition21420.8.規(guī)范曲線

經(jīng)過基線和熒光域值線的調(diào)整應(yīng)到達(dá)：

相關(guān)系數(shù)〔r值〕≥0.998斜率-3.0----3.5截距-40±4

〔這些參數(shù)根據(jù)儀器和試劑有所不同〕.....

室間質(zhì)評

參與衛(wèi)生部及省內(nèi)質(zhì)評方案原始記錄及結(jié)果報告室間質(zhì)評結(jié)果分析報告〔假設(shè)沒有分析報告，應(yīng)該開察看項(xiàng)還是不符合項(xiàng)？開在哪一條？〕不符合項(xiàng)〔緣由分析及整改措施有效性〕.溯源及丈量不確定度檢測系統(tǒng)配置的根本情況溯源性確認(rèn)的根本原那么不能溯源時，結(jié)果可靠性確實(shí)認(rèn)原那么丈量不確定度〔評審把握的尺度、詳細(xì)舉例〕.現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)選擇的原那么現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)的方式〔人員比對〕現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和斷定盲樣實(shí)驗(yàn)的根本要求.人員才干評審方式〔查看技術(shù)人員檔案、提問、現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)、現(xiàn)場操作〕實(shí)際知識〔防污染知識、生物平安知識〕技術(shù)才干問題處置〔發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和處理問題的才干〕

.座談會座談的原那么與技巧〔了解、關(guān)注臨床新技術(shù)新進(jìn)展〕關(guān)注的關(guān)鍵問題〔明確幾個必問的與專業(yè)相關(guān)的問題〕.≥100,00010,000-99,999HBVDNA

與肝細(xì)胞癌和肝硬化發(fā)生危險升高相關(guān)REVEAL:長期隨訪臺灣未治療的HBsAg陽性個體基線HBVDNA(拷貝/mL)患者(%)隨訪13年累積肝細(xì)胞癌的發(fā)生率[1](N=3653)504030201001.31.43.612.214.9隨訪13年累積肝硬化發(fā)生率[2](N=3582)4.55.99.823.536.2<300300-9991000-9999<300300-999910,000-99,999100,000-999,999≥1million1.ChenCJ,etal.JAMA.2006;295:65-73.

2.IloejeUH,etal.Gastroenterology.2006;130:678-686..1.000.960.920.880.840.800123456789101112SurvivaldistributionfunctionSurvivaltime(years)HBVDNAHigh(+)RR=9.9(3.2–31.0)HBVDNALow(+)RR=1.8(0.5–5.8)HBVDNA(-)ChenGetal.55thAASLDBoston,Nov2004;Poster2HCC病死率與基線HBV病毒載量的關(guān)系.HBVDNALow(+)RR=1.5(0.2–11.8)HBVDNA(-)HBVDNAHigh(+)RR=13.4(1.9–97.1)ChenGetal.55thAASLDBoston,Nov2004;Poster21.000.960