基因芯片技術(shù)原理與應(yīng)用美國(guó)CartesianProSys5510全自動(dòng)生物芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)全自動(dòng)生物芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)工作平臺(tái)PinArrayHeadVacuumWashStationSourcePlateSlidesVacummHold-DownSlideNest點(diǎn)樣針的類型SolidPinSplitPin載樣

PinshoudnotdiptoofarintosamplePinshoudtouchthebottomofwell15-20ulinaconicalwell96plate10ulinasquare-well384plate5ulinalowvolume384plate

1、連續(xù)點(diǎn)樣，一次取樣可點(diǎn)200-300個(gè)點(diǎn)2、可升級(jí)加裝非接觸式高速定量噴點(diǎn)系統(tǒng)3、片子容量：一次點(diǎn)片量：100片4、控制精確度：X/Y/Z位置步進(jìn)電機(jī)控制，精確點(diǎn)樣；真空吸附固定玻片；X-Y軸移動(dòng)速度：175mm/秒；一個(gè)周期速度（取樣、100張片點(diǎn)樣、洗針、干燥）：120秒；步進(jìn)電機(jī)步進(jìn)：1.3mm；點(diǎn)樣位置重現(xiàn)性：<±10mm5、點(diǎn)樣密度：不少于80,000點(diǎn)/片，點(diǎn)大?。?00-200mm6、點(diǎn)樣針：針型：裂縫針，實(shí)心針針容量：16根，可擴(kuò)展至32根7、樣品供給：96、384、1536孔板8、片子類型：玻璃片、膜、塑料片、硅膠片主要技術(shù)指標(biāo)與功能：美國(guó)PackardExpress生物芯片掃描分析系統(tǒng)

主要技術(shù)指標(biāo)與功能：

1．激光器：3只：紅色633nm,綠色543nm，黃色594nm2．檢測(cè)模式：激光共聚焦檢測(cè)3．掃描方式：分次掃描4．掃描芯片規(guī)格：標(biāo)準(zhǔn)芯片，25x76mm5．掃描視野：22mmx73mm6．像素點(diǎn)尺寸：多種像素點(diǎn)尺寸掃描方式，5，10，20，30和5mm7．激發(fā)光范圍：543nm到633nm8．發(fā)射光范圍：570nm到700nm，7種檢測(cè)光（570nm,578nm,592nm,614nm,660nm,670nm,694nm）9．靈敏度：≤0.1個(gè)熒光分子/mm210．掃描速度：20線/秒，整片掃描不超過(guò)5分鐘，11．動(dòng)態(tài)范圍：16bit,5個(gè)數(shù)量級(jí)12．圖形文件輸出格式：原始圖形數(shù)據(jù)（RAW）、TIFF,BMP，JPEG

基因芯片技術(shù)的原理

基因芯片技術(shù)的應(yīng)用

基因芯片技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程基因芯片技術(shù)的研究可能方向當(dāng)前面臨的困難一、基因芯片技術(shù)的原理

是將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過(guò)程(如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè))，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片技術(shù)有四大要點(diǎn)：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)。

生物芯片生物芯片的主要類型基因芯片(Genechip)又稱DNA芯片,它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測(cè)的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。它將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希缓笈c標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析。

蛋白質(zhì)芯片與基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是堿基配對(duì)而是抗體與抗原結(jié)合的特異性即免疫反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。蛋白質(zhì)芯片構(gòu)建的簡(jiǎn)化模型為：選擇一種固相載體能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)，這樣形成蛋白質(zhì)的微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。芯片實(shí)驗(yàn)室為高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)，它最終的目的是實(shí)現(xiàn)生化分析全過(guò)程全部集成在一片芯片上完成，從而使現(xiàn)有的許多煩瑣、費(fèi)時(shí)、不連續(xù)、不精確和難以重復(fù)的生物分析過(guò)程自動(dòng)化、連續(xù)化和微縮化，屬未來(lái)生物芯片的發(fā)展方向。

是最重要的一種生物芯片，也是目前研究最多的一種生物芯片?；蛐酒珼NA芯片的突出優(yōu)點(diǎn)在于：1、強(qiáng)大的類比性使得以往需多次處理的遺傳分析在同一時(shí)間和條件下快速完成。2、巨大的信息產(chǎn)出率

在一張芯片上不僅可以獲得組織、細(xì)胞、血液等基因表達(dá)信號(hào)的定性、定量分析，還可實(shí)現(xiàn)全局檢測(cè)靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、時(shí)間與空間上的差異及遺傳信息。3、高度敏感性和專一性

能可靠并準(zhǔn)確檢測(cè)出10pg/μl的DNA樣品。

4、高度重復(fù)性

一張由尼龍膜制作的微陣列，可以重復(fù)雜交使用多達(dá)20次。5、微型化和自動(dòng)化現(xiàn)已出現(xiàn)的芯片面積最大不過(guò)525cm２，最小僅有1cm２；每個(gè)陣列中陣點(diǎn)樣品DNA的用量?jī)H為5nl(05μg/μl)左右；試劑用量和反應(yīng)體積大大減少，反應(yīng)效率卻成百倍提高。6、哺育新的實(shí)驗(yàn)方法

此技術(shù)易與其它常規(guī)生物技術(shù)相融合交叉。基因芯片這些獨(dú)一無(wú)二的特點(diǎn)也代表了后基因組時(shí)代技術(shù)的發(fā)展方向。基因芯片的發(fā)展史基因芯片研究始于20世紀(jì)90年代，1993年美國(guó)斯坦福大學(xué)M.Schena博士在研究植物轉(zhuǎn)錄因子時(shí)有了制造芯片的構(gòu)思。1995年10月他和他的同事們獲得了成功，并在《自然》雜志上首次發(fā)表基因芯片的論文，這張芯片能一次性檢測(cè)45個(gè)基因表達(dá)的結(jié)果。1996年底，Schena與Affymatrix公司的S.Fodor創(chuàng)造了世界上第一塊DNA芯片。由此，1996年被譽(yù)為基因芯片的元年?；蛐酒砼c經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern、northern)一致，均應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對(duì)原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過(guò)熒光或同位素檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而得出所需要的信息。

基因芯片原理基因芯片按照其結(jié)構(gòu)基本上可分為兩種類型：

I型，將待測(cè)

DNA分子樣品固定在固相支持物上并與一系列游離的標(biāo)記探針雜交，雜交探針或是單一的或是混合的；II型，按照預(yù)先設(shè)定順序?qū)⒐押塑账峁潭ㄓ诠滔嘀С治锷显倥c標(biāo)記的DNA樣品進(jìn)行雜交，由已知的寡核苷酸序列確定被檢測(cè)的DNA樣品。

基因芯片的分類癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片(CRGEC)

目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品種.(上海博星公司)6400點(diǎn)的基因芯片（面積12X14mm)二、基因芯片技術(shù)的應(yīng)用基因表達(dá)分析

基因型、基因突變和多態(tài)性分析

疾病的診斷與治療

藥物研究中的應(yīng)用基因芯片中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

其它應(yīng)用

（一）基因表達(dá)分析1、分析基因表達(dá)時(shí)空特征

英國(guó)劍橋大學(xué)Whitehead研究所的FrankC.P.Holstege等人，應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應(yīng)用基因組水平的表達(dá)分析，監(jiān)測(cè)那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉(zhuǎn)錄因子均在基因的表達(dá)中有自己特定的作用位點(diǎn)[15]。通過(guò)本試驗(yàn)，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控作用。（2）細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究人員進(jìn)一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的分子機(jī)制。美國(guó)Stanford大學(xué)的V.R.Iyer等人[16]，對(duì)成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行了分析。通過(guò)基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜，有助于人類認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程和特征。2、基因差異表達(dá)檢測(cè)

生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問(wèn)題。人類基因組編碼大約10萬(wàn)個(gè)不同的基因，僅掌握基因序列信息資料，要理解其基因功能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的.利用基因芯片對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在60余萬(wàn)次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法，即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類?；蛐酒夹g(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

3、發(fā)現(xiàn)新基因有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明在缺乏任何序列信息的條件下，基因芯片也可用于基因發(fā)現(xiàn)，如黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子就是通過(guò)基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)的。4、大規(guī)模DNA測(cè)序人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動(dòng)化操作的測(cè)序方法的發(fā)展。DNA測(cè)序原理基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列?；蛐酒臏y(cè)序原理圖（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析

在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí)決定的，因此分析起來(lái)就十分困難，然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問(wèn)題，利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。

（三)疾病的診斷與治療

人類的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，基因芯片可以對(duì)遺傳信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，因此它在疾病的分子診斷中的優(yōu)勢(shì)是不言而喻的，是臨床一種新的、強(qiáng)有力的分子工具?；蛐酒夹g(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。

1、遺傳病相關(guān)基因的定位

90年代以來(lái),隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展,各種方法被相繼創(chuàng)立并應(yīng)用到基因定位中。DNA芯片充分結(jié)合并靈活運(yùn)用了大規(guī)模集成電路制造技術(shù)、自動(dòng)化技術(shù)、計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標(biāo)記探針、分子雜交及分子生物學(xué)的其它技術(shù),在這一領(lǐng)域的研究中有著巨大的潛力。這一技術(shù)已成為基因定位研究的高效工具。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析將越來(lái)越重要。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR(multiplex-PCR)/DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經(jīng)濟(jì)快速又敏感可靠。

2、腫瘤診斷已用基因芯片檢測(cè)人鼻咽癌、肺癌基因表達(dá)譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和定位。

人類惡性腫瘤中，約有60%與人類p53抑癌基因的突變有關(guān)，目前研究人員已經(jīng)研制成功了可以檢測(cè)p53基因所有編碼區(qū)（外顯子2～外顯子11）錯(cuò)意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。根據(jù)雜交后的熒光顯色圖，就可以分析出該位點(diǎn)為何種突變。

3、感染性疾病的診斷HIV-1基因組中rt與pro在疾病過(guò)程中易于發(fā)生多種變異，這些變異將導(dǎo)致病毒對(duì)多種抗病毒藥物出現(xiàn)明顯抗性，因此檢測(cè)和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。

4、耐藥菌株和藥敏檢測(cè)

據(jù)WHO報(bào)告，全球每年約有800萬(wàn)結(jié)核病患者，有300萬(wàn)人死亡，死亡人數(shù)超過(guò)了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對(duì)不同的藥物產(chǎn)生了抗藥性（俄國(guó)80%TB對(duì)一種藥物產(chǎn)生抗性；美國(guó)50%為多重耐藥）。對(duì)每例患者進(jìn)行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關(guān)鍵。最近，俄美兩國(guó)科學(xué)家開(kāi)發(fā)了具此功能的基因芯片，可使醫(yī)生及早使用敏感藥物。該芯片（TBBiochips）將抗性菌株的單鏈DNA標(biāo)記后固定在玻片上，與待檢TB株雜交，臨床使用未見(jiàn)假陽(yáng)性，該芯片可清洗后重復(fù)使用50次。

2023/10/18355、基因診斷基因芯片目前最主要的應(yīng)用之一就是疾病診斷。從正常人的細(xì)胞中分離出mRNA后與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的細(xì)胞中分離出mRNA后與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過(guò)分析比較這兩種圖譜，就可以得出病變的mRNA表達(dá)的信息，即DNA突變發(fā)生在何部位，屬于什么樣的序列突變。文獻(xiàn)報(bào)道了DNA芯片用于檢測(cè)遺傳性乳腺和卵巢癌基因BRCAl第11個(gè)外顯子的突變。檢測(cè)了15例病人樣品，發(fā)現(xiàn)其中14例有基因突變。在20個(gè)對(duì)照樣品中沒(méi)有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。研究者所用高密度DNA芯片包含96600種20mer寡核苷酸探針。探針以綠色熒光標(biāo)記，目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即靶分子標(biāo)記紅色熒光，完全雜交的分子產(chǎn)生黃色熒光信號(hào)。2023/10/1837BIOINFORMATICS

結(jié)果顯示攜帶BRCAl突變基因的雜合子來(lái)源的靶分子能與兩種探針雜交，說(shuō)明雜合子中包含了野生型及突變型兩種基因。Affymetrix公司把P53基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。2023/10/1838

又如，Heller等構(gòu)建了96個(gè)基因的cDNA微陣列，用于檢測(cè)分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）相關(guān)基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用。目前，多種診斷芯片包括結(jié)核桿菌耐藥性檢測(cè)芯片、肝炎病毒檢測(cè)芯片已逐步進(jìn)入市場(chǎng)，基因診斷是基因芯片中最具有商業(yè)化價(jià)值的應(yīng)用。（四）藥物研究中的應(yīng)用從經(jīng)濟(jì)效益來(lái)說(shuō)，最大的應(yīng)用領(lǐng)域可能是制藥廠用來(lái)開(kāi)發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開(kāi)發(fā)。對(duì)于尋找新藥來(lái)說(shuō)，目標(biāo)之一是應(yīng)用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)。采用所謂“譯碼器”策略（Decoderstrategy）來(lái)確定藥物靶標(biāo)。從而找到“導(dǎo)向藥物”?；蛐酒脖挥糜趯ふ业鞍准っ敢种莆?。細(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。1、新藥開(kāi)發(fā)

高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)。噬菌體展示技術(shù)可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì)，目前多用于抗體庫(kù)的建立和篩選，進(jìn)而可用于受體-配體相互作用的研究。除腫瘤外，用分子生物工程設(shè)計(jì)的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設(shè)計(jì)新的抗生素和工業(yè)用酶等。同時(shí)，有時(shí)一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新的功能。原先設(shè)想的作用是針對(duì)某一靶標(biāo)的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強(qiáng)的抑制作用，從而開(kāi)發(fā)成另一種新藥。２、調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況

基因芯片在用來(lái)研究藥物的作用機(jī)理時(shí)十分有用。這類研究既有助于闡明藥物的作用機(jī)制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。

３、對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)

應(yīng)用芯片查找藥物的毒性或副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究。尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表達(dá)的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達(dá)，則對(duì)它的深入研究就值得考慮。用芯片作大規(guī)模的表達(dá)研究往往可省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)。最近,一些科學(xué)家從人和小鼠文庫(kù)中選擇約600個(gè)與毒理學(xué)相關(guān)基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的毒理基因組學(xué)芯片，可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點(diǎn)的作用機(jī)制，也可用于確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性。2023/10/18434、藥物篩選

如何分離和鑒定藥的有效成分是目前中藥產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)的西藥開(kāi)發(fā)遇到的重大問(wèn)題，基因芯片是解決這一問(wèn)題的有效手段，它能夠大規(guī)模地篩選、通用性強(qiáng)，能夠從基因水平解釋藥物的作用機(jī)理，即可以利用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異。如果再以cDNA表達(dá)文庫(kù)得到的肽庫(kù)來(lái)制作肽芯片，則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)。2023/10/1844BIOINFORMATICS

利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，更有利于與靶分子相結(jié)合的特點(diǎn)，可將核酸庫(kù)中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此，芯片技術(shù)和RNA庫(kù)的結(jié)合在藥物篩選中有廣泛應(yīng)用。（五）基因芯片中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

1、中藥的研究，具體的方法，同上述藥物篩選方法類似

2、中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究

3、針灸原理研究

基因芯片可以幫助中醫(yī)藥走向世界研究天然藥物對(duì)人體的作用機(jī)制篩選對(duì)人體有生物效應(yīng)的單味天然藥物篩選對(duì)人體有生物效應(yīng)的有效成分篩選對(duì)人體有生物效應(yīng)的天然藥物配方中藥的研究。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學(xué)過(guò)程均被大大簡(jiǎn)化，將推動(dòng)中藥的迅猛發(fā)展。中藥學(xué)引入基因芯片技術(shù)，將大大推動(dòng)中藥研究的國(guó)際化進(jìn)程，為闡明中藥作用機(jī)理，具有無(wú)可估量的重要意義。

（六）其它應(yīng)用

1、環(huán)境化學(xué)毒物的篩選

2、體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究

三、基因芯片技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程基因芯片的微陣列制備基因芯片樣品制備

基因芯片雜交

基因芯片檢測(cè)

GeneChip的操作流程總RNA的提取----AAAA反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA體外轉(zhuǎn)錄LLLLLLL生物素標(biāo)記的cRNA片斷化處理帶標(biāo)記的cRNA片斷LL標(biāo)記的cRNA片斷L雜交液雜交混合液的制備Genechip雜交洗脫掃描數(shù)據(jù)分析2023/10/1852

在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必需考慮以下幾個(gè)方面：①互補(bǔ)性：探針與待檢測(cè)的目標(biāo)序列片段互補(bǔ)；②敏感性和特異性：要求探針僅僅對(duì)特定目標(biāo)序列片段敏感，而對(duì)其他序列不產(chǎn)生雜交信號(hào)；③容錯(cuò)性：通過(guò)探針設(shè)計(jì)，提高基因芯片檢測(cè)的容錯(cuò)性，常用的方法是使用冗余探針；2023/10/1853④可靠性：通過(guò)探針設(shè)計(jì)，提高基因芯片檢測(cè)的可靠性；⑤可控性：在基因芯片上設(shè)置質(zhì)量監(jiān)控探針，以便于監(jiān)控基因芯片產(chǎn)品的質(zhì)量；⑥可讀性：通過(guò)探針布局，使得最終的雜交檢測(cè)圖像便于觀察理解，如將檢測(cè)相關(guān)基因的探針?lè)旁谛酒舷噜彽膮^(qū)域；⑦高信號(hào)量的探針不要影響到其他探針的信號(hào)。2023/10/1854

在探針設(shè)計(jì)方面，最重要的是所有探針的雜交溫度要盡量接近。為了提高芯片對(duì)雜交錯(cuò)配的辨別能力，人們提出了一種優(yōu)化設(shè)計(jì)方法。該方法的基本思想是通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)各個(gè)探針的長(zhǎng)度及探針之間的覆蓋長(zhǎng)度，使所設(shè)計(jì)的各個(gè)探針的解鏈溫度Tm最大程度地保持一致，從而有效地提高對(duì)堿基雜交錯(cuò)配的辨別能力，提高基因芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。2023/10/1855BIOINFORMATICS

采用生物信息學(xué)中常用的動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法進(jìn)行優(yōu)化，以使得各個(gè)探針具有相近解鏈溫度作為優(yōu)化目標(biāo)，篩選并優(yōu)化組合各候選探針。在優(yōu)化組合時(shí)要求各探針的長(zhǎng)度和相鄰探針之間的交疊長(zhǎng)度滿足給定的約束條件，經(jīng)過(guò)優(yōu)化組合以后得到一組覆蓋目標(biāo)序列的探針。2023/10/1856基因芯片的制作。要成功的制作芯片，需要準(zhǔn)備三大材料：準(zhǔn)備固定在芯片上的生物分子樣品（即探針）、芯片片基和制作芯片的儀器。（一）基因芯片的微陣列制備

片基的處理微陣列構(gòu)建1、片基的處理APS-PDC修飾片基：APS指3-氨丙基三甲氧基硅烷，

PDC指1，4-苯二異硫氰酸鹽。此法被廣泛應(yīng)用。

多聚賴氨酸修飾片基：多聚賴氨酸與玻璃表面的負(fù)電荷結(jié)合吸附在玻璃表面上，DNA鏈帶正電荷可與玻片表面上的多聚賴氨酸結(jié)合，從而固定在玻片上。由于離子間相互作用比較弱，DNA固定率比較低。沒(méi)有被廣泛采用。巰基修飾片基：此方法中所用到的巰基和二硫基團(tuán)分別具有較強(qiáng)的氧化性和還原性，成品玻片的穩(wěn)定性較差，應(yīng)用不多。

原位合成直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位噴印合成2、微陣列構(gòu)建1、原位光蝕刻合成

寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的3‘羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)3'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。2、原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。直接點(diǎn)樣法將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大規(guī)模DNA芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。

適用于寡核苷酸；直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA較簡(jiǎn)單，只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。原位合成點(diǎn)樣法（二）基因芯片樣品制備分離純化、擴(kuò)增、獲取其中的DNA、RNA并用熒光標(biāo)記；或?qū)悠废瘸樘醡RNA，然后

反轉(zhuǎn)錄成cDNA。同時(shí)摻入帶熒光標(biāo)記的dCTP或dUTP。1、探針DNA（ProbeDNA)的合成

TheprobeDNAistheDNAwhichisappliedtotheDNAmicroarryandhybridizeswithcomplementaryDNAattachedtothesurfaceoftheslide.2、目標(biāo)DNA(TargetDNA)

TargetDNAisdefinedastheDNAtobeattachedtheglassslideandprobedbytheprobeDNA.分離純化、擴(kuò)增、獲取其中的DNA、RNA;或?qū)悠废瘸樘醡RNA，然后

反轉(zhuǎn)錄成cDNA。全自動(dòng)核酸蛋白純化站全自動(dòng)核酸蛋白純化站工作平臺(tái)

一般所需mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3μgmRNA計(jì)算的樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)．

氰代磷酸二乙酯(DEPC)離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門(mén)部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）。在RNase-Free0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。

用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫(xiě)明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。填寫(xiě)樣品登記表，寫(xiě)明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐保留1-2張取材部位的病理切片。（三）基因芯片雜交該反應(yīng)是指標(biāo)記的樣品與芯片上的靶基因進(jìn)行雜交，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的過(guò)程。

1、不依賴于酶反應(yīng)的雜交2、依賴于酶反應(yīng)的雜交3、二硫鍵修飾芯片兩步法延伸反應(yīng)雜交2023/10/1874適合于在玻璃片的雜交液有多種，比較典型的配方，如雜交溶液配方A（雜交溫度42℃）：50％甲酰胺，6×SCC，0.5％SDS，5×Denhardt試劑；

配方B（雜交溫度65℃）：6×SCC，0.5％SDS，5×Denhardt試劑；配方C（雜交溫度65℃）：10％SDS，7％的PEG－8000。用于檢測(cè)的基因芯片先進(jìn)行封閉預(yù)雜交30min，然后用含有靶基因的雜交液在雜交溫度下孵育8－24h，用清洗液清洗后離心干燥。2023/10/1875

雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變部位都必須檢測(cè)出來(lái)，通常設(shè)計(jì)出一套4種寡核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特定位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類。2023/10/1876如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡核苷酸即可，表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間，較低的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。

2023/10/1877此外，雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長(zhǎng)度及種類、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長(zhǎng)度的連接臂可以使雜交效率提高150倍。連接臂上的正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測(cè)基因均帶負(fù)電荷，因此影響它們之間的雜交結(jié)合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（PNA）做探針。2023/10/1878雖然PNA的制備比較復(fù)雜，但與DNA探針比較有許多特點(diǎn)，如不需要鹽離子，因此可防止檢測(cè)基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。由于PNA－DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。（四）基因芯片檢測(cè)芯片經(jīng)雜交反應(yīng)后，各反應(yīng)點(diǎn)形成強(qiáng)弱不同的光信號(hào)圖像，用芯片掃描儀和相關(guān)軟件加以分析，即可獲得有關(guān)的生物信息。

通常檢測(cè)芯片上的雜交信號(hào)需要高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)——閱讀儀（scannerorreader）。閱讀儀的成像原理分為激光共焦掃描和CCD成像兩種。激光共焦掃描與CCD相比，分辨率和靈敏度較高，但是掃描速度較慢且價(jià)格昂貴。經(jīng)熒光樣品雜交后的芯片，熒光信號(hào)可以經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或激光掃描儀進(jìn)行信號(hào)的收集，收集后的信號(hào)經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理，并與探針陣列位點(diǎn)進(jìn)行比較，可得出雜交的檢測(cè)結(jié)果。基因芯片生物信息學(xué)分析流程圖芯片原始數(shù)據(jù)圖像提取原始數(shù)據(jù)入庫(kù)NormalizationRation分析Cluster顯著性表達(dá)差異基因相似表達(dá)譜基因2023/10/1882檢測(cè)結(jié)果分析基因芯片檢測(cè)結(jié)果的分析主要包括三個(gè)方面：

1）熒光檢測(cè)圖像分析。基因芯片與熒光樣品雜交后，用圖像掃描儀器捕獲芯片上的熒光圖像。許多基因芯片研究機(jī)構(gòu)已開(kāi)發(fā)出一些基因芯片圖像處理軟件，例如GenePix、ImageGene、BioDiscovery、ScanAlyze等。2023/10/1883基因芯片圖像處理最基本的目標(biāo)是確定每個(gè)芯片單元的熒光強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度對(duì)比值（多色熒光標(biāo)記的情況下）。目標(biāo)看上去雖然簡(jiǎn)單，但是目前還沒(méi)有通用的處理方法。掃描和處理基因芯片圖像仍需要人工干預(yù)，以對(duì)齊網(wǎng)格線，保證正確標(biāo)定每個(gè)芯片單元的位置，同時(shí)還要能夠去除圖像上的污點(diǎn)以及其他形式的圖像噪聲。2023/10/18842）檢測(cè)結(jié)果分析。如果芯片檢測(cè)的目的是測(cè)定序列，則要根據(jù)芯片上每個(gè)探針的雜交結(jié)果判斷樣本中是否含有對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列，并利用生物信息學(xué)中的片段組裝算法連接各個(gè)片段，形成更長(zhǎng)的目標(biāo)序列；如果檢測(cè)的目的是進(jìn)行序列變異的分析，則要根據(jù)正確匹配探針以及錯(cuò)配探針（錯(cuò)配探針是指探針中有一個(gè)或幾個(gè)與靶基因核苷酸序列不同的探針）在基因芯片對(duì)應(yīng)位置上的熒光強(qiáng)度，給出序列變化的位點(diǎn)，并指明發(fā)生什么變化；2023/10/1885如果芯片檢測(cè)的目的是進(jìn)行基因表達(dá)分析，則需要給出芯片上各個(gè)基因的表達(dá)譜，定量描述基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析還包括基因表達(dá)模式進(jìn)行聚類，尋找基因之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)協(xié)同工作的基因。2023/10/18863）檢測(cè)結(jié)果可靠性分析?；蛐酒且粋€(gè)非常復(fù)雜的系統(tǒng)，包括許多環(huán)節(jié)，由于目前技術(shù)上的限制，在基因芯片制備、雜交及檢測(cè)等方面都可能出現(xiàn)誤差，芯片檢測(cè)結(jié)果并非100％可靠。2023/10/1887因此，必須對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果作出可靠性的評(píng)價(jià)?？煽啃苑治鲋饕獜膬蓚€(gè)方面進(jìn)行：一是根據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)誤差（如探針合成的錯(cuò)誤率、全匹配探針與錯(cuò)誤探針的誤識(shí)率等），計(jì)算出基因芯片最終結(jié)果的可靠性；二是對(duì)基因芯片與樣品序列雜交過(guò)程進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)研究，建立芯片雜交過(guò)程的計(jì)算機(jī)仿真實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以便在制作芯片之前分析所設(shè)計(jì)芯片的性能，預(yù)測(cè)芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。1、樣品制備上，當(dāng)前多數(shù)公司在