天然纖維素類物質(zhì)在固體發(fā)酵中的應(yīng)用

世界每年可生產(chǎn)1000萬噸植物纖維材料。而如何將這些可再生資源轉(zhuǎn)化成可被人類直接利用的小分子物質(zhì),仍是一個(gè)難題。近二、三十年來,纖維素酶的研究與應(yīng)用為此開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。我國許多科研人員在纖維素粉、秸稈、稻草等應(yīng)用于纖維素酶的固體、液體發(fā)酵方面也做了許多研究工作。秸稈、稻草粉等天然纖維素類物質(zhì)應(yīng)用于固體發(fā)酵具有生產(chǎn)成本低,生產(chǎn)效率低且易污染等特點(diǎn);經(jīng)加工處理的純纖維素粉用于液體發(fā)酵雖然生產(chǎn)效率高,工藝條件易控制,但在規(guī)模生產(chǎn)上生產(chǎn)成本過高,不利于纖維素酶的推廣應(yīng)用。因此,嘗試將天然纖維素類物質(zhì)應(yīng)用于液體發(fā)酵降低成本,不但可以促進(jìn)纖維素酶在食品、紡織、飼料,能源等行業(yè)的普及應(yīng)用,同時(shí)還可以減輕秸稈等農(nóng)作物下腳料焚燒對(duì)環(huán)境的污染。1材料和方法1.1病毒自選綠色木霉突變株A10-01。1.2培養(yǎng)基1.2.1表面活性劑馬鈴薯PDA葡萄糖培養(yǎng)基。1.2.2小麥麩皮的制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1000ml):蛋白胨3.0g,硫酸銨2.0g,酵母膏0.5g,磷酸二氫鉀4.0g,氯化鈣0.3g,硫酸鎂0.3g,草粉,麩皮適量。微量元素液(1000ml):硫酸亞鐵5.0g,硫酸錳1.6g,硫酸鋅1.4g,氯化鈷2.0g。1.2.3種子培養(yǎng)麩皮加10倍體積水,煮沸20min,過濾,取汁,補(bǔ)足水至10倍體積。1.2.4母膏的制備蛋白胨120g,硫酸銨80g,酵母膏20g,磷酸二氫鉀160g,氯化鈣12g,硫酸鎂12g,草粉,麩皮適量(粉碎,過100目)。1.2.5還原糖的測定采用DNS法測定。稱取50±0.5mg新華濾紙,加1ml,pH4.4,檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,加入適當(dāng)稀釋的酶液1.0ml,50℃反應(yīng)1h,加入1mlDNS試劑測定還原糖。以上酶活均扣除發(fā)酵液中的還原糖后計(jì)算酶活力,其酶活力定義為每小時(shí)分解生成1mg葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位。2結(jié)果與分析2.1原料預(yù)處理處理天然纖維素是以直鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)存在的,由排列整齊而規(guī)則的結(jié)晶區(qū)和相對(duì)不規(guī)則,松散的無定型區(qū)組成。同時(shí),纖維素大多與半纖維素、木質(zhì)素共生,而半纖維素、木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的催化作用存在一些抑制作用,因此需要對(duì)原料進(jìn)行必要的預(yù)處理。對(duì)原料的處理一般采用酸、堿處理以及爆破處理。我們對(duì)山草粉分別采用0.75%的硫酸水解,0.7%的氨水處理,6.5bar壓力下爆破處理,均能取得一定效果,但最終在發(fā)酵中產(chǎn)酶量并不十分理想。經(jīng)過多次反復(fù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),對(duì)于山草粉首先采用6.5～7.0bar壓力爆破處理,再用0.7%～1.0%的氨水浸泡過夜后清水洗滌。其產(chǎn)酶量將提高15%～22%。2.2不同碳源濃度對(duì)發(fā)酵的影響綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶是復(fù)合酶,同時(shí)也是誘導(dǎo)酶。以單一的山草粉作碳源,并不能有效地促進(jìn)產(chǎn)酶。在木霉合成這些酶時(shí),通常需要一些低分子量的碳水化合物及其它營養(yǎng)因子。麩皮因含有淀粉,纖維素,半纖維素,有機(jī)氮及生長因子等營養(yǎng)物質(zhì),而被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵行業(yè)中。在以山草粉與麩皮作為復(fù)合碳源的實(shí)驗(yàn)中,由于它們極易吸水膨脹,容易堵塞發(fā)酵罐管道,所以很難進(jìn)行高濃度發(fā)酵。經(jīng)不同濃度實(shí)驗(yàn),以4.0%的總碳源濃度較合適。在此基礎(chǔ)上實(shí)驗(yàn)了草粉與麩皮的不同配比濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響,結(jié)果見表1。2.3接種量法制備fpa酶活綠色木霉A10-01斜面培養(yǎng)5d后,接孢子一環(huán)于搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。分別以6%、8%、10%、12%的接種量接種于50l發(fā)酵罐中,29℃培養(yǎng)6d,測定FPA酶活。結(jié)果見圖1。當(dāng)接種量不足時(shí),發(fā)酵前期營養(yǎng)過多地提供菌絲生長,發(fā)酵后期營養(yǎng)不足,產(chǎn)酶偏低;當(dāng)接種量偏大時(shí),發(fā)酵前期菌絲生長旺盛,容易結(jié)團(tuán),同樣不利于后期產(chǎn)酶;故以10%的接種量比較合適。2.4接種時(shí)植物教加擬合種子質(zhì)量的高低直接影響到發(fā)酵后期產(chǎn)酶量的大小。因此,選擇合適的種子培養(yǎng)時(shí)間,是纖維素酶發(fā)酵的關(guān)鍵之一。由于絲狀菌在培養(yǎng)過程中容易產(chǎn)生菌絲團(tuán),如果接種后菌絲團(tuán)不能散開,僅表面菌絲向四周伸展而菌絲團(tuán)的中央結(jié)塊,就會(huì)使內(nèi)部菌絲的營養(yǎng)吸收和呼吸受到影響,從而不能正常地生長,同時(shí)也導(dǎo)致菌絲濃度過低,產(chǎn)酶下降。接種過早或過晚,都會(huì)導(dǎo)致菌絲結(jié)團(tuán),菌絲生長緩慢,不利于產(chǎn)酶。從圖2中可以看出,種子培養(yǎng)時(shí)間為48～52h,產(chǎn)酶較高。2.5不同季節(jié)動(dòng)態(tài)發(fā)酵采用培養(yǎng)48h的種子,接種10%,于29℃發(fā)酵4d后,開始在不同時(shí)間段采樣測酶活。結(jié)果見圖3,發(fā)酵3d后菌絲濃度達(dá)到最大值,并隨后進(jìn)入生長穩(wěn)定期,開始產(chǎn)酶;培養(yǎng)到第4、5d時(shí),酶活急劇增加,第6d時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰期,隨后進(jìn)入衰退期。2.6不同通氣量的菌體在搖瓶培養(yǎng)的全過程中,采用一次性全過程培養(yǎng),不改變其它實(shí)驗(yàn)條件。搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果見表2。在50l罐的發(fā)酵過程中,采用29℃,0.6～0.8個(gè)大氣壓,400r/min。在培養(yǎng)初期0～12h,由于菌體幼嫩且數(shù)量較少,故采用較低風(fēng)量0.8m3/h;在菌體生長對(duì)數(shù)期即12～80h,通氣量逐步增加到2.4m3/h有利于菌體的大量繁殖;在酶活已經(jīng)明顯提高以后,為防止菌體過早老化,降低通氣量為1.6～1.8m3/h。在這種分時(shí)段控制通氣量的發(fā)酵條件下,最高酶活可達(dá)到23.3u/ml。2.7ph控制的影響在纖維素酶的合成過程中,pH的控制被認(rèn)為是產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素之一。對(duì)于綠色木霉A10-01菌株,在搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,控制pH6.0有利于菌絲生長及產(chǎn)酶。在50l罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,采用了如下的pH控制方法:發(fā)酵前期即菌體大量生長繁殖期,控制pH6.0有利于菌絲體的大量繁殖,增加菌絲濃度。在對(duì)數(shù)生長期基本結(jié)束,菌絲已經(jīng)開始產(chǎn)酶即80h以后,一次性加入已經(jīng)滅菌的磷酸鹽緩沖液,控制pH值4.5左右,將更利于后期產(chǎn)酶。3發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響(1)對(duì)山草粉原料進(jìn)行必要的預(yù)處理,破壞纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的緊密結(jié)合區(qū),增加纖維比表面積。其產(chǎn)酶量將提高15%～22%。(2)在50l罐的發(fā)酵中,山草粉與麩皮的總濃度對(duì)產(chǎn)酶非常關(guān)鍵。濃度過低,菌絲量降低,不利于后期產(chǎn)酶;過高又會(huì)堵塞管道,因此以4.0%的總濃度較合適。(3)培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)48h的種子,接種10%,29℃培養(yǎng)6d;發(fā)酵前80h控制pH6.0,發(fā)酵后期控制pH4.5;發(fā)酵0～12h,通氣量為0.8m3/h,12h～80h,通氣量為2.4m3/h,80～144h,通氣量為1.6～1.8m3/h;在此控制條件下,山草粉用于纖維素酶液體發(fā)酵