不同處理對穗花狐尾藻生理響應的影響

水生植物是水生生態(tài)系統(tǒng)的主要初級生產(chǎn)者，不僅能為浮游生物和底棲生物提供棲息地和誘餌，還能抑制藻類的生長和過度繁殖，對水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能以及水體的健康發(fā)揮著重要作用。然而，幾十年來，水下植物在水體富營養(yǎng)化過程中逐漸萎縮和消失。許多關(guān)于水下植物退化和減少的文章報道了高劑量銨氮的威脅，這可能是減少水下植物萎縮的一個重要因素。因此，科學家們對沉積物中不同濃度的銨氮對水生植物葉片生理的影響研究得更多。在沉積物水界面的遷移和轉(zhuǎn)化過程中，很少有關(guān)于水下植物根系和葉片等器官生理特征的報告。通常在高濃度銨態(tài)氮脅迫下,植物生長明顯受到抑制,表現(xiàn)出葉片變黃、光合作用受阻、碳和氮代謝失調(diào),K+、Ca2+和Mg2+等陽離子吸收受到限制等.也有研究顯示,高濃度銨態(tài)氮環(huán)境植物光呼吸增加,以及產(chǎn)生過量乙烯和多胺.此外,高濃度銨態(tài)氮還可以誘導植物組織器官抗氧化酶活性的變化和脂膜過氧化反應.Wang等研究表明,高濃度氯化銨在短期內(nèi)(4~8d)可顯著降低沉水植物苦草(Vallisnerianatans)的葉綠素含量,產(chǎn)生大量的超氧自由基(O2-·)和過氧化氫(H2O2),進而誘導葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性增加,但氯化銨濃度高于1.2mmol·L-1時,葉片SOD活性開始下降.金相燦等研究認為,銨態(tài)氮質(zhì)量濃度在1.5~4.0mg·L-1時,就會對輪葉黑藻產(chǎn)生脅迫作用,而銨態(tài)氮質(zhì)量濃度達到8.0mg·L-1時,穗花狐尾藻生長明顯受到抑制.沉積物在淡水生態(tài)系統(tǒng)中既充當了氮“源”,同時也起到了氮“匯”的作用.隨著工、農(nóng)業(yè)的發(fā)展,大量的無機氮(尤其是銨態(tài)氮)被源源不斷的排入水體,進而被沉積物吸附和礦物晶格固定.另外,沉積物有機氮通過礦化作用產(chǎn)生的礦質(zhì)氮在厭氧環(huán)境中主要以銨態(tài)氮形式存在于沉積物中,而死亡的生物有機體腐解后也是沉積物銨態(tài)氮的重要來源.筆者以往的研究顯示,長江中下游淺水湖泊沉積物中銨態(tài)氮(包括可交換態(tài)銨和固定態(tài)銨)濃度可達719mg·kg-1,其中可交換態(tài)銨在116~269mg·kg-1之間.因此,在富營養(yǎng)化淡水生態(tài)系統(tǒng)沉水植被恢復過程中,底質(zhì)中銨態(tài)氮的影響不容忽視.穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)是一種在我國廣泛分布的沉水植物.由于其生長迅速,再生能力強,可生長在不同營養(yǎng)水平的淡水環(huán)境中,因此在富營養(yǎng)化湖泊生境修復過程中得到了普遍應用.本試驗在溫室模擬條件下,通過為沉積物添加氯化銨作為營養(yǎng)底質(zhì),研究穗花狐尾藻對高濃度銨態(tài)氮環(huán)境脅迫的生理響應,旨在揭示富營養(yǎng)化淡水生態(tài)系統(tǒng)中沉水植被衰退的原因和機制,為富營養(yǎng)化淡水生態(tài)系統(tǒng)沉水植被的恢復提供理論依據(jù).1材料和方法1.1沉積物的篩選和貯藏沉積物采自中國環(huán)境科學研究院池塘,自然風干后,用重物搗碎,經(jīng)篩選去掉雜質(zhì),并過0.5mm細篩1~2次,力求其理化性質(zhì)均勻一致,篩選好的沉積物置于干燥通風處備用.沉積物使用前置于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌除去單細胞藻類和真菌.狐尾藻采自北京十渡拒馬河,將采回的植物在室內(nèi)預培養(yǎng)1周.1.2樣品的預處理試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,共設(shè)3個處理:沉積物不加氯化銨處理(CK),沉積物添加0.24%(占沉積物干質(zhì)量)氯化銨處理(SN1)和沉積物添加0.48%的氯化銨處理(SN2).每處理重復3次.其詳細過程為:將備用的沉積物樣品用千分之一電子天平稱量,分成若干份,每份為2800g,置于鋁箔紙上,與事先稱量好的氯化銨充分混勻,裝入潔凈的PVC小桶(高20cm、直徑18cm)內(nèi),加自來水完全浸沒沉積物,2h后,將PVC小桶轉(zhuǎn)移至體積為1m3(長×寬×高:1m×1m×1m)的潔凈玻璃缸內(nèi),扦插種植經(jīng)過預培養(yǎng)健壯的狐尾藻頂枝部分(約10cm),每個PVC小桶內(nèi)6株,加自來水至玻璃缸刻度線,約為0.8m3,定期補充水量.1.3生理指標的測定狐尾藻培養(yǎng)28d后收獲,每個處理取3個PVC小桶內(nèi)狐尾藻用自來水沖去底泥,洗去吸附在植物表面的雜質(zhì),再用去離子水沖洗3~5次.用濾紙吸干植物表面水分,分根、莖和葉用萬分之一電子天平測定鮮質(zhì)量,105℃殺青2h后,80℃恒溫箱內(nèi)烘干至恒量,測定干物質(zhì)量后,放置干燥器內(nèi)備用.另取部分新鮮葉片和根系測定生理指標.其中葉綠素含量采用丙酮提取法測定(mg·g-1DM);可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定(mg·g-1FM);丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定(μmol·g-1FM);超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光化還原法測定,過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定,酶活性用U·mg-1蛋白(protein)表示.在同一天內(nèi)采集上覆水樣品測定總有機碳(TOC)、總氮(TN)、銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)含量,采集沉積物樣品,離心去掉間隙水,真空冷凍干燥,過100目篩后測定沉積物中TN、可交換態(tài)銨(NH4+-N)和NO3--N含量.1.4差異統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進行分析.采用單因素方差分析(one-wayANOVA)和最小顯著差異法(LSD)分析不同數(shù)據(jù)組間的差異.2結(jié)果與分析2.1沉積物nh4+-n的轉(zhuǎn)化由表1可見,添加氯化銨顯著提高了沉積物、間隙水和上覆水NH4+-N濃度,促進了上覆水NH4+-N的轉(zhuǎn)化.培養(yǎng)后第28天,SN1和SN2處理沉積物NH4+-N濃度分別是CK的33.55和70.47倍;間隙水NH4+-N濃度分別是CK的386.31和950.50倍;上覆水中NH4+-N和NO3--N濃度分別為CK的52.40、243.00倍和242.00、310.33倍.2.2穗花織物鮮生物量和根系鮮株高的變化由圖1可見,高濃度NH4+-N顯著抑制了穗花狐尾藻的生長.與對照相比,SN1和SN2處理穗花狐尾藻地上部(莖和葉)鮮生物量分別降低了17.25%和81.25%;根系鮮生物量分別降低了43.42%和80.26%;株高分別降低了15.66%和55.52%;平均根長分別降低了45.72%和67.65%.2.3穗花配置蛋白類、激素活性由圖2可見,高濃度銨態(tài)氮對穗花狐尾藻葉片和根系都產(chǎn)生了脅迫作用.與對照相比,SN1和SN2處理的穗花狐尾藻葉片和根系SOD活性均顯著降低(P<0.01和P<0.05),但SN1和SN2處理之間則無顯著差異(P>0.05).SN2處理的穗花狐尾藻葉片POD活性顯著低于CK(P<0.001),而SN1與CK處理之間則無顯著差異(P>0.05);與葉片相反,SN1和SN2處理的穗花狐尾藻根系POD活性均顯著高于CK(P<0.01和P<0.001).穗花狐尾藻葉片CAT活性均以SN1和SN2處理顯著低于CK處理(P<0.05和P<0.01);而根系CAT活性則以SN1和SN2處理顯著高于CK處理(P<0.01和P<0.05).2.4系丙二醛含量高濃度NH4+-N脅迫加速了穗花狐尾藻脂膜過氧化反應,促使葉片和根系丙二醛(MDA)含量顯著升高(圖3).由圖3可見,與對照相比,SN1和SN2處理中穗花狐尾藻葉片的MDA含量分別提高了46.30%和82.75%,根系MDA含量分別提高了19.66%和55.19%.3nh4+-n濃度本研究中,SN1和SN2處理的沉積物、間隙水和上覆水NH4+-N濃度比CK提高了幾十至幾百倍.盡管SN1和SN2處理上覆水中NO3--N濃度顯著增加,但沉積物和間隙水中NO3--N濃度變化相對較小(表1).其原因主要表現(xiàn)在兩個方面:1)添加氯化銨顯著提高了沉積物與間隙水、間隙水與上覆水之間的NH4+-N濃度梯度,因此促進了沉積物中NH4+-N向間隙水和上覆水中遷移.2)大多數(shù)情況下沉積物環(huán)境為厭氧條件,而添加的NH4+-N很難在厭氧環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)化.相反,上覆水中溶解氧含量較高,提高了NH4+-N的硝化作用,進而導致上覆水中NO3--N濃度的明顯增加(表1).本研究中,隨著沉積物添加氯化銨量的增加,穗花狐尾藻株高、根長和生物量均顯著降低(圖1).前人在研究水體中NH4+-N濃度對水生植物生長影響的報道中也有類似的結(jié)論.然而,不同水生植物對NH4+-N的耐受能力表現(xiàn)不盡一致.浮游蕨類植物Azollaficuloides在NH4+-N濃度高于0.1mmol·L-1的污水中,生長速率顯著下降,當生長在更高的NH4+-N濃度(>1mmol·L-1)環(huán)境中,根系嚴重受損;微齒眼子菜(Potamogetonmaackianus)在水體NH4+-N濃度超過0.5mmol·L-1時生長開始受到抑制;槐葉萍在NH4+-N濃度超過5mmol·L-1時,根系和葉片生長顯著受到抑制,而當NH4+-N濃度超過15mmol·L-1時,植物老葉片開始死亡;穗花狐尾藻在NH4+-N質(zhì)量濃度梯度為0~4.0mg·L-1時,隨著NH4+-N濃度升高,其株高、根長和鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)增加趨勢,而當NH4+-N質(zhì)量濃度達到8.0mg·L-1時,其株高、根長和鮮質(zhì)量則開始顯著降低,生長明顯受到抑制.可見,不同水生植物在水體NH4+-N達到一定濃度時均會表現(xiàn)毒性響應.很多研究報道,植物生長在高NH4+-N環(huán)境中容易導致氧化脅迫,從而誘導植物體內(nèi)抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性發(fā)生變化.抗氧化酶系統(tǒng)中,SOD是植物氧化脅迫過程中的第一道防御系統(tǒng),它可以將植物體內(nèi)的過氧化物歧化為H2O2.在CAT和POD的作用下,植物體內(nèi)H2O2可以進一步降解為H2O和O2.在大多數(shù)自然條件下,植物體內(nèi)SOD、POD和CAT活性可維持在一定水平.當外界環(huán)境改變時,隨著環(huán)境氧化脅迫的加強,SOD、POD和CAT活性顯著提高,從而有效清除了由于氧化脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基,減少或者緩解了植物膜質(zhì)過氧化反應而造成的損害.盡管如此,當植物生長的環(huán)境較為惡劣時,活性氧的增加很可能會遠遠超過抗氧化酶系統(tǒng)的正常歧化能力,從而導致植物體氧化代謝失調(diào),抗氧化酶活性降低,嚴重時可導致植物死亡.本研究中,穗花狐尾藻葉片SOD、POD和CAT活性均隨環(huán)境中NH4+-N濃度的增加呈現(xiàn)降低趨勢,并且在更高濃度NH4+-N的環(huán)境中(SN2)SOD、POD和CAT活性顯著下降.穗花狐尾藻根系SOD活性與葉片表現(xiàn)一致,均為SN1和SN2處理顯著低于CK處理.盡管如此,根系POD和CAT活性則以SN1和SN2處理顯著高于CK處理(圖2).可見,在高濃度NH4+-N環(huán)境中,穗花狐尾藻葉片抗氧化酶系統(tǒng)受到了嚴重影響,從而導致SOD、POD和CAT活性顯著下降.在前人研究中也有類似的結(jié)果.Wang等研究表明,當水體NH4+-N濃度高于1.2mmol·L-1時,4d后苦草(Vallisnerianatans)葉片SOD活性開始顯著下降.金相燦等研究顯示,當NH4+-N質(zhì)量濃度超過4.0mg·L-1時,28d后穗花狐尾藻葉片SOD和POD活性均開始下降.本研究中,假設(shè)僅考慮上覆水中NH4+-N濃度的影響,在培養(yǎng)后第28天,SN1和SN2處理的上覆水NH4+-N濃度均高于4.0mg·L-1(5.24和24.30mg·L-1),而此時SN1和SN2處理的穗花狐尾藻葉片SOD和POD活性均低于CK,與金相燦等的研究結(jié)果一致.與對照相比,在高濃度NH4+-N環(huán)境(SN1和SN2)中穗花狐尾藻根系POD和CAT活性顯著增加,表明根系對高濃度NH4+-N的耐受能力要高于葉片,可能與水生植物長期生存的環(huán)境條件有關(guān),其影響機制還有待進一步研究.丙二醛(MDA)是植物衰老或逆境環(huán)境中植物脂膜過氧化的產(chǎn)物之一.MDA含量升高通常是植物質(zhì)膜發(fā)生嚴重過氧化損傷的標志,間接地表示膜受損情況.在自然條件下,植物可通過酶促和非酶促反應使細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài),不易導致脂膜過氧化.然而,當植物遭受嚴重逆境脅迫時,細胞內(nèi)活性氧自由基逐漸積累,從而促使脂膜過氧化,造成細胞膜系統(tǒng)的損傷,干擾植物細胞的光合、呼吸及其他代謝過程,嚴