臺灣青棗多酚氧化酶的特性及3種抑制劑對其促褐變的影響

多酚氧化酶（ppo）是一種由核基因編碼的銅金屬酶。其酶促褐變機制是：由于多酚氧化酶的加速，內(nèi)源性酚類物質氧化生成，然后相互作用產(chǎn)生高度結合的聚合物，導致褐色素的形成。它能催化兩類不同的反應,可以使一元酚羥基化,生成相應的鄰二羥基化合物;也可以氧化鄰苯二酚生成醌。果實的褐變不僅影響外觀、降低營養(yǎng)價值,而且往往是敗壞不可食用的標志。近年來,對多酚氧化酶在果品加工中的影響研究日益受到重視,在番荔枝、橄欖、中國木瓜、荔枝、蘋果、葡萄等植物的加工中均有報道。但對臺灣青棗PPO的活性及影響活性因素的研究則未見報道。臺灣青棗由于品種成熟期差異,12月至次年4月份有成熟鮮果上市,新鮮果實的貨架期較短,在水果貯藏及果品加工中容易發(fā)生褐變。筆者主要采用分光光度法研究臺灣青棗多酚氧化酶(PPO)的催化特性、最適波長、最適反應時間、最適溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性等性質,同時研究了抗壞血酸、檸檬酸、L-半胱氨酸3種抑制劑對臺灣青棗多酚氧化酶活力的影響,以尋求在果品保鮮以及果肉初加工過程中抑制PPO活性的各控制手段與果品加工的有機結合方法,為防止褐變提供有效、合理的措施,為果實貯藏保鮮及在果品加工中保持其原有營養(yǎng)和風味提供有效方法,并為其在果品加工的安全生產(chǎn),提高產(chǎn)品質量,防止褐變,開發(fā)臺灣青棗新的經(jīng)濟價值提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面青棗為市場購得的八成熟、外觀良好、無機械損傷、新鮮的臺灣青棗。1.2儀器、設備和水浴鍋試劑:鄰苯二酚、抗壞血酸、L-半胱氨酸、檸檬酸、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、甘氨酸等,以上試劑均為分析純。儀器:722型光柵分光光度計(上海光學儀器有限公司);PHS-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司);T-214電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);LD-5型電動離心機(江蘇省榮華儀器制造有限公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市華普達教學儀器有限公司);電冰箱(BCD-217YBHaier);研缽、離心管、試管若干。1.3方法1.3.1粗酶液提取液與無砂透膜液的制備參考詹嘉紅的方法并稍作修改。臺灣青棗果實洗凈去皮,去核,按5∶6(W/V)比例加入預冷的0.07mol/LpH值6.5的磷酸鹽緩沖溶液,冰浴搗碎至勻漿,置冰箱浸提30min,取出解凍至室溫(16℃)5000r/min離心10min,吸取上清液作為粗酶液提取液,0～4℃保存?zhèn)溆谩?.3.2吸收波長的確定參考胡青霞等的方法并略作修改。以鄰苯二酚為底物,反應體系包括PPO提取液2ml,0.2mol/L鄰苯二酚1ml,0.2mol/LpH值6.5的磷酸鹽緩沖液1ml。在30℃恒溫水浴鍋中保溫,反應20min后用酶液加2ml磷酸緩沖溶液作對照,各加三氯乙酸(TCA)0.2ml。在波長405～460nm,每隔10nm測定一次吸光度值,以波長為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制吸收曲線,確定最適吸收波長(λ)。酶的活性以最適吸收波長處比色的吸光度A值表示。1.3.3磷酸鹽緩沖液5.5%h分別取2ml粗酶液加入反應體系(0.2mol/L鄰苯二酚1ml、0.2mol/LpH值6.5的磷酸鹽緩沖液1ml)各在30℃恒溫水浴鍋中保溫1、5、10、20min。酶液加2ml磷酸緩沖溶液作對照,測定吸光度值,以確定臺灣青棗PPO最佳反應時間。1.3.4溫度對ppo表達的影響反應體系在溫度18～90℃條件下反應20min,然后測定吸光度值,以溫度為橫坐標,以吸光度為縱坐標,作出吸光度—溫度曲線,以確定PPO反應的最適溫度。分別取2ml粗酶液在70、80、90℃恒溫1、5、10、20min。取出迅速冷卻至室溫,以2ml原粗酶提取液作為反應對照,分別加入0.2mol/LpH值6.5的磷酸鹽緩沖溶液1ml,0.2mol/L鄰苯二酚1ml。反應20min后,加入0.2ml三氯乙酸終止反應。于波長420nm處比色測定吸光度值。比較不同的滅酶方法對PPO反應體系的滅活效果。1.3.5緩沖液的配制用磷酸二氫鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制同一濃度不同pH值的緩沖液。取2mlPPO粗酶液,1ml0.2mol/L鄰苯二酚,1ml0.2mol/L不同pH值緩沖液混合均勻,水浴30℃下加熱20min后測定PPO活性,以吸光度值A表示。1.3.6抑制劑用量的影響處理對比組同上。選用檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸作為抑制劑進行單因素實驗。配制濃度各為0.05%抑制劑,分別取0.5ml加入反應體系,以粗酶液對照測定吸光度值。作出吸光度—抑制濃度曲線,比較相同濃度下各種抑制劑對臺灣青棗PPO活性的影響,以確定最佳抑制劑。1.3.7l-半胱氨酸反應時間處理對比組同上。配制質量濃度分別為0.0250%、0.0375%、0.0500%、0.1000%、0.2000%、0.3000%的L-半胱氨酸,各取1ml加入反應體系,于30℃水浴恒溫反應20min后加入0.2ml三氯乙酸終止反應。于波長420nm處比色測定吸光度值。2結果與分析2.1加鄰苯二酚分光光度法檢測ppo活性由圖1可見,臺灣青棗PPO作用生成產(chǎn)物最大吸收波長為420nm。其吸收光波值為0.490。所以,以鄰苯二酚為底物測定臺灣青棗中PPO活性時,確定420nm為最適測定波長。此結果與湯鳳霞等在枇杷果漿多酚氧化酶活性抑制的研究和熊何健等在荔枝殼中多酚氧化酶活性研究一致。2.2反應時間及時間由圖2可見,在最初5min反應非常緩慢,5min后,反應速度加快,當反應時間達20min時,酶促褐變的反應現(xiàn)象開始明顯。故反應時間以20min為宜。2.3高溫處理對臺灣青棗ppo活性的影響溫度對多酚氧化酶活性的影響是雙重的。不同的酶,最適溫度不同。由初步實驗得出,臺灣青棗PPO的最適溫度在30℃左右。由圖3可見,吸光度在低溫范圍內(nèi)即16～30℃,隨溫度的升高而升高,當溫度在30℃前和70℃后臺灣青棗PPO活性很低。低溫貯藏可使食品自身體內(nèi)酶活性下降,代謝減慢,從而延長食品的儲藏期,故是較理想的臺灣青棗水果貯藏方法。而在果品加工制作過程中,高溫處理可有效抑制酶的褐變?？梢钥紤]結合瞬間高溫處理的方法使其不可逆變性,減少酶促褐變對后續(xù)加工的影響。在探討不同的溫度條件下與滅酶所需要的時間的關系時(表1、圖4),發(fā)現(xiàn)70℃以上高溫處理均能使PPO活性顯著降低。在90℃組的曲線呈略微上升現(xiàn)象,則可能是PPO在長時間的高溫加熱過程中加快其催化反應速度,與殘留在粗酶液中的酚類物質發(fā)生催化反應和發(fā)生了美拉德反應的緣故。也可能是酶促反應產(chǎn)物醌類物質不穩(wěn)定:由于PPO粗酶液中可能含有抗壞血酸等抗氧化劑,生成的產(chǎn)物鄰-醌被抗壞血酸還原為鄰苯二酚。2.4ppo對臺灣青棗的影響由圖5可知,以鄰苯二酚為作用底物時臺灣青棗PPO的最適pH值為6.8。當pH值<5.0或>8.0時,臺灣青棗PPO活力已得到顯著抑制。由于PPO是堿性的含銅蛋白質,pH值影響酶活性催化基團的解離狀態(tài),在較強的酸性條件下,輔基銅將以銅離子的形式解離出來,從而使酶失活。而在堿性條件下銅會解離成氫氧化銅,使酶活性顯著降低。因此,調(diào)節(jié)pH值能有效抑制PPO活性,可以減輕臺灣青棗果品加工中酶促褐變的影響。2.5不同給藥劑量對臺灣青棗ppo活性的影響由表2可見,當選用相同濃度0.05%的檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸作為抑制劑進行單因素實驗時,其對臺灣青棗PPO活性的抑制由強到弱的排列次序是L-半胱氨酸>抗壞血酸>檸檬酸。其中,L-半胱氨酸對臺灣青棗PPO活性的抑制效果最好,分別是抗壞血酸的2倍和檸檬酸的6倍。3種添加劑均對臺灣青棗PPO活性有一定的抑制作用,在果品加工過程中可根據(jù)經(jīng)濟價格因素、綠色食品加工要求,采用各不同抑制劑的適量濃度來作為有效抑制臺灣青棗酶促褐變的措施。2.6質量濃度對抑制率的影響由表3可見,L-半胱氨酸對臺灣青棗PPO活性的抑制效果很明顯。在質量濃度為0.0250%時抑制率已達25.5%。并在質量濃度為0.1000%時突增至68.6%,其濃度為0.2000%和0.3000%呈稍微下降的趨勢。3高溫和高溫條件下的處理(1)臺灣青棗PPO的酶促褐變產(chǎn)物在可見光波長420nm處有最大吸收峰。最佳反應時間為20min,最適pH值為6.8。臺灣青棗PPO對熱較敏感,其最適溫度為30℃。(2)當溫度在30℃前臺灣青棗活性很低,低溫貯藏方法仍是臺灣青棗較理想的貯藏方法。在70～90℃的高溫條件下加熱PPO均有較明顯的鈍化效果。因此,在果品加工中可以結合利用瞬間高溫滅酶的方法作為抑制褐變的措施。(3)當pH值<5.0或>8.0時,臺灣青棗PPO活力已得到顯著抑制。因此調(diào)節(jié)pH值能有效抑制PPO活性,可以減輕臺灣青棗果品加工中酶促褐變的影響。(4)檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸對臺灣青棗PPO活性均有一定的抑制作用。在相同濃度下,對臺灣