草屬藥用植物hplc指紋圖譜及測定方法研究

草莓自古以來就被用作浮游植物。jatamansijuna在《明朝英雄方法》中也有記載。它主要治療腹部腫脹、疼痛、消化不良、腹瀉、痢疾和其他疾病。該藥物于1977年獲得了《中國藥典》版本。纈草V.officinalisL.根和根莖入藥,性平味辛,具有鎮(zhèn)靜安神,解痙止痛之功,主治心神不安,心悸失眠,癲狂,臟躁,風濕痹痛,脘腹脹痛,痛經(jīng),經(jīng)閉,跌打損傷。一直以來,作為溫和的鎮(zhèn)靜、安神、催眠藥,其藥用價值在世界上受到高度重視,且作為高檔煙用香精原料,不少國家已經(jīng)對其進行開發(fā),產(chǎn)值不菲。目前關于纈草屬藥用植物的質(zhì)量控制和分析方法報道不多,對其極性成分指紋圖譜的研究未見報道。為了深入了解我國纈草屬藥用植物資源,從中尋找療效確切的具有鎮(zhèn)靜作用的國產(chǎn)新資源,使其得到充分合理的利用,同時也為了更有效地控制纈草類藥材的品質(zhì),作者采用HPLC/UV對其極性成分指紋圖譜進行了研究。1水、糖、橙皮苷-環(huán)已酸乙酯nmrHP1050型高效液相色譜儀,二極管陣列檢測器。乙腈為色譜純(美國Fisher公司);水為娃哈哈純凈水,并經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾;綠原酸購于中國藥品生物制品檢定所;橙皮苷自行提取精制,經(jīng)UV,IR,NMR等鑒定結(jié)構(gòu),純度大于99.5%(歸一化法計算)。實驗中所用纈草屬藥用植物均經(jīng)筆者鑒定,見表1。2方法2.1檢測柱和檢測波長默克C18色譜柱(4mm×125mm,5μm),預柱為C18柱(8mm×10mm,5μm)。柱溫40℃,流速0.95mL·min-1,檢測波長280nm。乙腈和水每100mL分別加0.1moL·L-1的磷酸1mL。梯度洗脫條件見表2。2.2藥材的提取精密稱取各樣品粉末(經(jīng)20目篩)10g,包在濾紙筒中,置索氏提取器內(nèi),用正己烷水浴回流提取至無色。將提取后的藥材粉末干燥,再用二氯甲烷、甲醇依次同上法提取至無色。甲醇提取液濃縮至25mL,放冷,過濾,取濾液再過0.45μm微孔濾膜為供試品溶液。2.3對照溶液的制備精密稱取綠原酸、橙皮苷,加甲醇制成每1mL甲醇含綠原酸3.2mg,橙皮苷3.2mg的溶液作為對照品溶液。2.4穩(wěn)定性考察標準取同一份纈草屬藥用植物(實驗編號4)的供試液重復進樣5次,比較不同色譜峰的絕對保留時間、相對保留時間及峰面積比值。因進樣間隔時間為90min,故同時對該方法進行了穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明所標定色譜峰的絕對保留時間、相對保留時間及峰面積比值基本一致(RSD分別為0.02%～2.3%,0～1.9%,0～2.7%),符合指紋圖譜檢測要求。2.5相對保留時間及峰面積比值的測定取纈草屬藥用植物(樣品編號4)樣品5份,分別精密稱定,按2.2項方法制備供試品溶液,并分別按上述液相色譜條件測定,計算不同指紋峰的相對保留時間及峰面積比值。結(jié)果表明所標定色譜峰的絕對保留時間、相對保留時間及峰面積比值基本一致(RSD分別為0.01%～0.36%,0～0.75%,0～2.6%),符合指紋圖譜檢測要求。3hplc-iii，用于藥物性興奮植物極性成分的hplc注釋和參數(shù)3.1指紋峰的確定按上述液相色譜條件對7份纈草屬藥用植物樣品(表1中的1～7號樣品)進行了測定,樣品中所有成分的色譜峰在60min之內(nèi)出完,比較各樣品的色譜圖,其中12個峰是共有的,確定為指紋峰(見圖1)。各共有峰的紫外吸收(共有峰峰號)為:202,256nm(3),218(sh),324nm(4,9,10,12);202,276nm(5,6,8);202(sh);282nm(7,11)。3.2細以綠原酸為參照,把各色譜峰保留時間與同一圖譜中綠原酸保留時間的比值作為各色譜峰的相對保留時間。結(jié)果各共有峰峰號(相對保留時間)為:1(0.11),2(0.70～0.73),3(0.85～0.86),4(1.00),5(1.12～1.14),6(1.23～1.26),7(1.68～1.70),8(1.96～1.99),9(2.52～2.58),10(2.75～2.80),11(2.85～2.90),12(3.31～3.39)。精密吸取對照品溶液10μL,按上述色譜條件測定,以所得的綠原酸峰面積作為1,計算各樣品圖譜中色譜峰的峰面積比值,結(jié)果各共有峰的峰號(峰面積比值)為:1(0.03～0.10),2(0.05～0.10),3(0.06～0.09),4(0.79～1.40),5(0.07～0.11),6(0.06～0.08),7(0.23～0.38),8(0.16～0.18),9(0.09～0.27),10(0.31～0.91),11(0.27～1.52),12(0.25～0.97)。7號峰和12號峰有時出現(xiàn)肩峰。3.3號樣品的表征筆者同時采用上述液相色譜條件測定了幾種不同植物來源的纈草屬植物樣品(表1中的8～16號樣品),見圖2。各樣品極性成分的HPLC圖譜與所建立的纈草屬藥用植物極性成分的指紋圖譜比較結(jié)果見表3。結(jié)果表明,其他植物來源的各纈草屬藥用植物的樣品的極性成分HPLC圖譜與來源于蜘蛛香的樣品差別明顯,對纈草屬藥用植物的真?zhèn)舞b別有重要意義。4草屬藥用植物不同樣品的hplc指紋圖譜的比較分析4.1筆者建立了纈草屬藥用植物極性成分的HPLC測定方法,該方法能使纈草屬藥用植物甲醇提取物中的大部分化學成分得到較好分離,具有很好的穩(wěn)定性、重復性和可行性。4.2在液相色譜條件建立的過程中,筆者比較了波長190～400nm所測得的HPLC圖譜(DAD檢測器檢測),結(jié)果表明,波長280nm檢測時,其HPLC圖譜中可見比較多的色譜峰,同時各色譜峰分離較好;并且該波長接近所選用對照品綠原酸的最大吸收波長;故確定波長280nm為檢測波長。4.3本實驗所應用的峰面積比值計算方法不同于文獻。由于纈草屬藥用植物不同樣品HPLC指紋圖譜中,各共有峰的峰面積均有一定的波動,故筆者認為不宜把各樣品色譜圖中某一共有峰峰面積均作為1來計算峰面積比值。因此,本實驗以已知濃度的綠原酸參照物溶液,固定體積進樣后,同樣色譜條件所得峰面積作為1,計算峰面積比值。這樣既消除了一定的系統(tǒng)誤差,又能客觀地反映不同樣品中各共有峰所代表的化學成分的含量高低。通過纈草屬藥用植物指紋圖譜主要特征峰的面積比例的制定,亦能有效地控制中藥纈草的質(zhì)量,確保纈草樣品質(zhì)量的相對穩(wěn)定。4.4利用所建立的纈草屬藥用植物極性成分的HPLC指紋圖譜的特征性(如其穩(wěn)定的共有峰相對保留時間),有效地區(qū)分了所收集的來源于蜘蛛香的樣品和其他植物來源的樣品,對纈草類藥材的鑒別具有重要意義。蜘蛛香、纈草、寬葉纈草、黑水纈草、長序纈草,這5種植物藥材極性成分的HPLC圖譜相互之間存在較大差別;而同一植物來源的不同樣品極性成分的HPLC圖譜基本一致,其差別明顯小于不同植物的樣品HPLC圖譜;鑒于幾種纈草樣品性狀、顯微特征及原植物形態(tài)較相近,故可以認為從化學成分的角度進行區(qū)分應該是有效的途徑,可以從化學分類上為纈草屬這幾種植物的分類提供佐證。另外,本研究結(jié)果也提示,在制定指紋圖譜的過程中,對于多來源的中藥材,應把不同