PAGEPAGE19第十一章植物離體無性繁殖1植物離體無性繁殖的概念和特點(diǎn)植物有兩種基本生殖方式：\t”_blank"有性生殖和現(xiàn)象，即開始繼代培養(yǎng)時(shí)，需較高濃度生長調(diào)節(jié)物質(zhì),隨繼代時(shí)間延長,加人生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的量減少或不加入就可以使其生長。所以，在階段Ⅱ中，應(yīng)注意調(diào)整培養(yǎng)基激素濃度。對(duì)生長速度快或繁殖系數(shù)高的植物，繼代時(shí)間應(yīng)短（15d左右)；反之，繼代時(shí)間應(yīng)長（30－40d)。階段Ⅱ以培養(yǎng)細(xì)胞或愈傷組織方式繼代增殖的植物，形態(tài)發(fā)生能力易隨繼代時(shí)間延長而減弱或喪失,原因是：①愈傷組織培養(yǎng)時(shí)逐漸喪失了成器官中心(擬分生組織)；②內(nèi)源激素減少;③染色體畸變積累?？赏ㄟ^外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加、篩選具有形態(tài)發(fā)生能力的細(xì)胞團(tuán)、縮短繼代時(shí)間等措施防止其再生能力的喪失,最好的辦法是重新建立細(xì)胞系.此外，階段Ⅱ中的增殖率、污染、玻璃化等因素也影響著試管苗生產(chǎn)的效率和經(jīng)濟(jì)效益。4。5移栽階段Ⅳ的成功與否直接影響著植物快繁的成本、工作效率及經(jīng)濟(jì)效益.如葡萄試管苗移栽成本占總成本的56%～78％。在高濕、恒溫、弱光下生長的異養(yǎng)試管苗，出瓶移栽后易導(dǎo)致其死亡，盲目移栽馴化，將導(dǎo)致快繁工作前功盡棄。試管苗出瓶移栽后導(dǎo)致其死亡的因素包括：4.5。1根系結(jié)構(gòu)根系結(jié)構(gòu)不完善的試管苗移栽后，易造成死亡。死亡原因及克服方法為:①不生根。一些植物，特別是木本植物的試管苗不生根，無法移栽，可采用嫁接法解決.②根與輸導(dǎo)系統(tǒng)不連接.從愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的根與已分化芽的輸導(dǎo)系統(tǒng)不相通。可將芽切割下來轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中,重新誘導(dǎo)根的形成。③根無根毛或很少。許多試管植株再生根上無根毛,將小苗移栽前置人液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，有時(shí)可促進(jìn)根毛發(fā)育。④根無吸收功能或極低。有些試管苗再生根的吸收功能無或很低，移栽前將試管苗在培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間(如1個(gè)月），可恢復(fù)根的吸收功能。4。5.2葉表皮組織葉表皮組織不發(fā)達(dá)或結(jié)構(gòu)不正常的試管苗，移栽后也易造成死亡。表現(xiàn)為：①葉表角質(zhì)層和蠟質(zhì)層不發(fā)達(dá)或無.②葉無表皮毛或極少。③葉解剖結(jié)構(gòu)稀疏。試管苗、溫室苗和大田苗的葉柵欄細(xì)胞厚度和葉組織間隙存在明顯差異.④氣孔開口大，不關(guān)閉。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),試管苗氣孔始終處于開放狀態(tài)，保衛(wèi)細(xì)胞變圓,氣孔開張很大.⑤葉片存在排水孔。在長期高濕環(huán)境中，試管苗葉片出現(xiàn)排水孔，導(dǎo)致移栽后極易失水干枯。⑥光合作用能力極低。試管苗柵欄組織少而小，細(xì)胞間隙大，影響葉肉細(xì)胞中二氧化碳的吸收和固定。為了克服上述不利因素，可采用的措施有：①馴化鍛煉。使試管苗健壯、堅(jiān)實(shí)，形成表皮正常組織結(jié)構(gòu),恢復(fù)氣孔功能。試管苗的馴化鍛煉過程為：出瓶移栽前先打開瓶口進(jìn)行2～3d濕度鍛煉,然后移栽到高濕、弱光、溫度適宜并略低的環(huán)境中,逐步降低空氣相對(duì)濕度，增加光照強(qiáng)度，直至小植株適應(yīng)自然環(huán)境。②瓶內(nèi)培育壯苗.試管苗能否從異養(yǎng)過渡到自養(yǎng),其自身生活力起決定作用.凡生活力強(qiáng)、健壯、有較發(fā)達(dá)根系的試管苗易移栽成活.在培養(yǎng)基內(nèi)添加PP333、CCC等植物生長延緩劑,增加光照強(qiáng)度，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度等是培育壯苗的有效途徑。5植物離體快繁的應(yīng)用5。1提高繁殖系數(shù)，縮短新品種推廣所用時(shí)間雖然通過離體培養(yǎng)方法可以既經(jīng)濟(jì)又安全地生產(chǎn)、保存、繁殖和運(yùn)輸無病毒植物，但當(dāng)前微繁最主要的用途是替代傳統(tǒng)的營養(yǎng)繁殖方法以增加繁殖系數(shù)。通過組織培養(yǎng)，由一塊很小的、甚至是極微的植物組織，在12個(gè)月之內(nèi)可以產(chǎn)生100萬以上植株，如此之高的繁殖速度是用任何傳統(tǒng)的無性繁殖方法所不能達(dá)到的.用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行植物繁殖的優(yōu)點(diǎn)在于枝條的增殖周期很短（2~6周),而每個(gè)周期都能導(dǎo)致枝條數(shù)的幾何級(jí)數(shù)增長.此外，在組織培養(yǎng)中，植物的繁殖可以不受季節(jié)影響，一年到頭連續(xù)進(jìn)行。目前，有很多種園藝植物，如非洲紫羅蘭、香蕉、桉樹、蕨類植物、非洲菊、大巖桐、蘭花和杜鵑花等，都正在大規(guī)模地用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行繁殖。在離體條件下植物繁殖系數(shù)的提高，必然會(huì)顯著縮短一個(gè)新品種由選育到推廣所需的時(shí)間.由于通過檢疫的植物材料其數(shù)量一般都是有限的，因此，微繁也應(yīng)當(dāng)能夠加速通過檢疫之后新作物的引種。5.2保存種質(zhì)資源，節(jié)約保存用地在存在著嚴(yán)重病害問題的情況下,植物離體繁殖方法比非無菌繁殖法有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)：通過離體方法不僅可把無病原菌植物既可靠又經(jīng)濟(jì)地保存起來，而且一旦需要，無論什么季節(jié)都可立即進(jìn)行快速繁殖。在苗圃中，通過組織培養(yǎng)可以最大限度地減少用于保存原種所需的土地面積,在一個(gè)大約3m×3m×5m房間里的培養(yǎng)架上所放置的培養(yǎng)瓶，即可保存幾十億個(gè)植株。5.3在雌雄異株植物中有選擇地繁殖所需性別的植株在雌雄異株植物中，種子繁殖后代有50％雄株和50％雌株,但在有些情況下，生產(chǎn)上只希望種植其中一個(gè)性別的植株，因此營養(yǎng)繁殖就極為重要。例如在石刁柏中,雄株比雌株價(jià)值高，但現(xiàn)在還不能通過莖插條進(jìn)行無性繁殖。Yang(1977)介紹了一種由嫩芽快速克隆這種植物的離體方法。木瓜是另一種雌雄異株植物，在靠種子進(jìn)行繁殖的果園中，由于要淘汰大量雄株，而淘汰又只有在植株長到開花期時(shí)才能進(jìn)行，因此造成的損失很大,若對(duì)雌株進(jìn)行離體無性繁殖,就可以避免這種損失.6植物離體快繁中存在的一些問題6。1物種的局限性離體無性繁殖是一種生產(chǎn)技術(shù),現(xiàn)已被世界上很多苗圃用于各種各樣的草本和木本植物。不過，很多難以用傳統(tǒng)方法繁殖的重要樹木，包括若干裸子植物,離體繁殖技術(shù)還未過關(guān).為了克服這個(gè)局限性仍須進(jìn)行大量的研究工作。6。2無性系變異（遺傳不穩(wěn)定)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞、組織和再生植株均會(huì)出現(xiàn)各種變異,且具普遍性,涉及的植物性狀也相當(dāng)廣泛。6.2.1影響遺傳穩(wěn)定性的因素影響培養(yǎng)材料遺傳穩(wěn)定性的因素有：①基因型。培養(yǎng)材料的基因型不同,發(fā)生變異的頻率也不相同。②繼代次數(shù)。試管苗繼代培養(yǎng)次數(shù)和時(shí)間是造成遺傳變異的關(guān)鍵因素,一般隨繼代次數(shù)和時(shí)間的增加，變異頻率呈上升趨勢。如香蕉誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的過程中，繼代5次時(shí)的變異率為2.14％，10次為4.2％，20次后則為100%,因而香蕉繼代培養(yǎng)不能超過1年.蝴蝶蘭連續(xù)培養(yǎng)4年后，植株退化，不開花，因此原球莖應(yīng)2年更換一次莖尖。③器官發(fā)生方式。離體器官5種發(fā)生方式中，以莖段、莖尖等形成的叢生芽、單芽的方式繁殖，不易發(fā)生變異或變異率極低。如葡萄莖段快繁,經(jīng)過5~8年繼代培養(yǎng),其變異頻率與常規(guī)方法相同，數(shù)萬株中只有一株產(chǎn)生變異；菊花莖尖、腋芽培養(yǎng)，變異率較低，而花瓣誘導(dǎo)的變異率較高。6。2.2降低遺傳變異的措施降低遺傳變異發(fā)生的方法有：①選用不易發(fā)生遺傳變異的基因型材料；②縮短繼代時(shí)間，限制繼代次數(shù)，繼代一定時(shí)間后，重新開始外植體的繼代培養(yǎng)；③采用不易發(fā)生遺傳變異的增殖途徑；④采用適當(dāng)?shù)纳L調(diào)節(jié)物質(zhì)和較低的濃度,減少或不使用易引起誘變的物質(zhì)，及時(shí)剔除生理和形態(tài)異常苗。6。3培養(yǎng)物污染污染是指在組培過程中，由于真菌、細(xì)菌等微生物的侵染,在培養(yǎng)容器中滋生大量菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育的現(xiàn)象.6。3。1污染發(fā)生原因污染通常是由下列原因引起：①培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器及各種接種器皿、器械滅菌不徹底;②外植體滅菌不徹底;③操作時(shí)人為帶入；④環(huán)境（接種室的環(huán)境、培養(yǎng)室的環(huán)境）不清潔;⑤超凈工作區(qū)域不清潔.在植物大規(guī)模微繁期間，即使外植體在一開始進(jìn)行了嚴(yán)格的表面消毒，某些慢速生長的病原菌（特別是內(nèi)生菌）可能依然存在，但只有在培養(yǎng)物經(jīng)過多次繼代之后，這些污染物才表現(xiàn)出來并被人們所發(fā)現(xiàn)。污染物的長期存在會(huì)引起試管苗生活力下降，葉片缺綠，甚至死亡。在培養(yǎng)基中添加抗生素或殺菌劑有可能控制這些污染物的進(jìn)一步擴(kuò)展，但不可能殺滅這些污染物。所以最好的辦法還是要從未受病原菌侵染的或已經(jīng)過脫毒檢驗(yàn)的植株上切取外植體。6.3.2控制污染的措施針對(duì)引起污染的原因，控制的方法有：①培養(yǎng)基及各種接種器皿的滅菌要徹底，嚴(yán)格遵守滅菌操作規(guī)程②接種器具每次使用后應(yīng)用酒精灼燒;③污染的外植體材料應(yīng)及時(shí)淘汰，如果種源有限，對(duì)外植體材料可進(jìn)行二次滅菌;④操作人員接種時(shí)應(yīng)用75％的酒精擦拭雙手和培養(yǎng)瓶表面,操作區(qū)內(nèi)不要放人過多待用培養(yǎng)瓶,防止氣流被擋住；⑤接種環(huán)境應(yīng)定期用福爾馬林等熏蒸滅菌,經(jīng)常用紫外燈照射滅菌;⑥超凈工作臺(tái)應(yīng)定期對(duì)初過濾器清洗和更換，提前15~20min打開，并用75％酒精擦拭整個(gè)工作臺(tái)。⑦植物材料的表面消毒要徹底。⑧培養(yǎng)室保持清潔。⑨封口膜保持完好、密封。6。4玻璃化玻璃化現(xiàn)象(Vitrification)是植物組織培養(yǎng)過程中試管苗特有的一種生理失調(diào)或生理病變，多數(shù)發(fā)生在植物莖尖培養(yǎng)和離體快繁中.玻璃苗生長繁殖速度下降，最后甚至死亡。6。4。1玻璃苗和正常苗相比，玻璃苗矮小腫脹,節(jié)間很短或幾乎沒有，葉片水漬化，半透明,厚而狹長，皺縮或縱向卷曲，脆弱易碎,葉表缺少角質(zhì)層，沒有功能性氣孔器.顯微觀察表明，玻璃苗葉片不具有柵欄組織,僅有海綿組織。玻璃化苗由于體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低，角質(zhì)層、柵欄組織發(fā)育不全，因而光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低,生根困難，移栽后不易成活。6.4。2玻璃化苗發(fā)生原因玻璃化苗是在芽分化啟動(dòng)后的生長過程中，由碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理異常所引起的,由多種因素影響和控制，主要原因?yàn)?①培養(yǎng)基的瓊脂和蔗糖濃度。瓊脂和蔗糖濃度與試管苗玻璃化程度呈負(fù)相關(guān),即瓊脂或蔗糖濃度越高，試管苗的玻璃化程度越低.瓊脂和蔗糖濃度影響著培養(yǎng)基的滲透勢，滲透勢不適時(shí),試管苗的玻璃化程度增加。瓊脂濃度還影響著培養(yǎng)瓶內(nèi)空氣濕度，高濕條件下試管苗生長快，玻璃化發(fā)生頻率相對(duì)高。②培養(yǎng)溫度.培養(yǎng)溫度與玻璃化程度呈正相關(guān)，即培養(yǎng)溫度越高，玻璃化程度也越高。溫度影響著試管苗的生長速度，一定范圍內(nèi)的高溫,試管苗的生產(chǎn)和代謝受到影響，促進(jìn)玻璃化的產(chǎn)生。③生長調(diào)節(jié)劑濃度。高濃度的細(xì)胞分裂素可促進(jìn)芽分化,也使玻璃化發(fā)生比例提高。細(xì)胞分裂素與生長素的比例失調(diào)，試管苗正常生長所需的激素水平失衡，導(dǎo)致玻璃化發(fā)生。但不同植物發(fā)生玻璃化的激素水平是不一致的.如香石竹在6—BA為0.5mg／L時(shí),就有玻璃化發(fā)生；但非洲菊在不定芽誘導(dǎo)中，6-BA的濃度可達(dá)5。0～10.0mg／L，不定芽增殖時(shí),6—BA的濃度則只能是1。0mg／L。④培養(yǎng)瓶中乙烯濃度.非受傷的物理和化學(xué)脅迫可加速乙烯的合成，促使玻璃化的發(fā)生。⑤光照。植物在光照時(shí)間10～12h／d、光照強(qiáng)度1500～20001x的條件下，能夠正常生長和發(fā)育。當(dāng)光照不足再加上高溫，易引起試管苗過度生長，加速玻璃化發(fā)生。⑥培養(yǎng)基含氮量.培養(yǎng)基含氮量高，特別是銨態(tài)氮含量高，易引起玻璃化發(fā)生.6。4。3玻璃化苗發(fā)生機(jī)理玻璃化苗的產(chǎn)生是由于內(nèi)源激素乙烯在代謝調(diào)節(jié)中所起的關(guān)鍵性啟動(dòng)作用。試管苗在脅迫培養(yǎng)環(huán)境中，如水勢不當(dāng)、通氣不暢、生長調(diào)節(jié)劑濃度過高、溫度過高等，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。培養(yǎng)瓶空氣中過剩的乙烯抑制了試管苗體內(nèi)乙烯的生物合成,但誘發(fā)了其他激素質(zhì)和量的改變及酶類變化，如降低苯丙氨酸解氨酶和酸性過氧化物酶的活性,從而發(fā)生蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，壁壓降低，細(xì)胞過分吸水，導(dǎo)致玻璃化苗形成.另外,培養(yǎng)瓶中氣體組成的改變，也影響著磷酸戊糖途徑、光呼吸途徑的進(jìn)行。當(dāng)磷酸戊糖途徑受阻時(shí),細(xì)胞壁再生受抑制，戊糖化合物減少，核酸、蛋白質(zhì)合成受阻；當(dāng)光呼吸途徑被抑制時(shí),減弱了光呼吸對(duì)光合的保護(hù)作用,過剩的同化力損壞了光合細(xì)胞器，降低了光合作用，阻礙了乙酸醇的轉(zhuǎn)化，加重了乙酸醇對(duì)植物的毒害作用，從而導(dǎo)致試管苗玻璃化的發(fā)生。6。4。4防止玻璃化苗發(fā)生的措施防止玻璃化苗產(chǎn)生的途徑有：①提高培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)基水勢;②提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基滲透勢；③利用可透氣性瓶塞材料,降低培養(yǎng)瓶中過飽和濕度，增加氣體交換；④減少培養(yǎng)基中含氮化合物、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的用量；⑤增加光照強(qiáng)度,適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，并進(jìn)行晝夜變溫處理;⑥一些添加物或抗生素可減少或防止玻璃化發(fā)生，如馬鈴薯汁、活性炭可降低油菜玻璃化苗頻率，CCC、PP333可減少重瓣絲石竹(Crypsophilaelegans）玻璃化的發(fā)生,聚乙烯醇可防止蘋果砧木玻璃化,青霉素G鉀可防止菊花玻璃化，青霉素可降低芥菜玻璃化等.6。5褐化褐化是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì),致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象.褐化的發(fā)生是由于組織中多酚氧化酶被激活,酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下,與培養(yǎng)材料組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其他酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長受阻。6.5。1褐化發(fā)生的影響因素有:①植物種類和品種。植物體內(nèi)所含單寧及其他酚類化合物的數(shù)量不同，發(fā)生褐化的頻率和嚴(yán)重程度也相差很大。一般木本植物酚類化合物的含量較草本植物高，因此，木本植物更易發(fā)生褐化，增加組織培養(yǎng)難度.如核桃單寧含量很高，極易褐變，接種初期就褐化,繼而在形成愈傷組織后會(huì)因褐化而死亡。②外植體年齡、大小和取材時(shí)間.外植體越老化，木質(zhì)素含量越高,越易褐化.外植體材料越小，越易發(fā)生褐化。生長季節(jié)的外植體含有較多的酚類化合物。③外植體損傷。外植體切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面越大，褐化程度越嚴(yán)重。④光照.外植體取材前進(jìn)行母株遮光處理，可有效抑制褐化發(fā)生，因?yàn)檠趸^程中的許多反應(yīng)受酶系統(tǒng)控制,而酶系統(tǒng)的活性又受光照影響。⑤溫度。溫度對(duì)褐化的發(fā)生影響很大，低溫可減輕褐化發(fā)生,因?yàn)榈蜏匾种品宇惢衔镅趸?降低多酚氧化酶活性。⑥培養(yǎng)時(shí)間過長。接種材料轉(zhuǎn)移不及時(shí)，導(dǎo)致褐化發(fā)生，甚至全部死亡。⑦培養(yǎng)基成分.培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度和細(xì)胞分裂素濃度過高，易導(dǎo)致材料褐化。6。5。2防止褐化的措施防止褐化發(fā)生的有效措施是：①在冬春季節(jié)選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w，即外植體應(yīng)具有較強(qiáng)分生能力;②選擇適宜的培養(yǎng)基，調(diào)整激素用量;