參苓白術(shù)散對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道調(diào)節(jié)性細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究

潰瘍性胃炎（iu）是一種非特異性炎癥。目前,UC病因及發(fā)病機(jī)制不十分明確,臨床常用糖皮質(zhì)激素和5-氨基水楊酸類藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎,但此類藥物存在嚴(yán)重副作用。新近研究發(fā)現(xiàn),CD4+CD25+T細(xì)胞(regulatoryTcell,Treg)在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用,其數(shù)量缺乏或功能缺陷可直接引起人和動物多種自身免疫性疾病。據(jù)報(bào)道,參苓白術(shù)散以其有效的治療效果和較少的副作用被廣泛應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療,然而目前對于其具體機(jī)制的研究并不明了。本實(shí)驗(yàn)建立TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型,應(yīng)用參苓白術(shù)散進(jìn)行治療,揭示Treg在UC小鼠腸道中的變化規(guī)律,探索參苓白術(shù)散對UC的作用機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物中心昆明小鼠,雄性,60只,體質(zhì)量18~22g,由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物許可證編號為SCXK(冀)2008-1-003。1.2tnbs和t-對p3抗體檢測參苓白術(shù)散購于山西華康藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z14020346。地塞米松購于武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)有限公司。TNBS購于Sigma公司;大鼠抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25、AlexaFluor(2)488-Foxp3抗體,Biolegend公司產(chǎn)品;Foxp3固定破膜試劑盒,eBioseienee公司產(chǎn)品。1.3小鼠腸道調(diào)節(jié)性t細(xì)胞比例的檢測實(shí)驗(yàn)分為正常對照組,TNBS模型組,參苓白術(shù)散高劑量組,參苓白術(shù)散中劑量組,參苓白術(shù)散低劑量組,地塞米松組。每組10只。除正常對照組外,乙醚麻醉小鼠,用直徑為1mm的聚乙烯導(dǎo)管從肛門插入腸道約3cm,緩慢注入TNBS/乙醇溶液0.1mL(3mg/mL,40%乙醇)。小鼠被倒置1min以確保TNBS/乙醇溶液能在腸道均勻分布。給藥后6h,正常對照組和TN-BS模型組灌胃0.2mL生理鹽水,每天1次;地塞米松組在造模后1、3、5、7、9d給予地塞米松(1mg/kg,皮下注射),參苓白術(shù)散溶解于生理鹽水中,參苓白術(shù)散低、中、高劑量組按照0.2mL藥液體積灌胃,藥物質(zhì)量濃度分別為140、280、560mg/mL。連續(xù)用藥10d,造模第11天,處死小鼠。在冰浴條件下取結(jié)腸,測定結(jié)腸長度;取腸系膜淋巴結(jié),測定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例;結(jié)腸液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存,以備檢測結(jié)腸勻漿細(xì)胞因子水平。1.4測量的長度1.5熒光標(biāo)記巖石細(xì)胞的制備取小鼠腸系膜淋巴結(jié),PBS緩沖液沖洗兩遍,5mL注射器針芯研磨腸系膜淋巴結(jié),300目尼龍布過濾,260×g離心5min收集細(xì)胞。調(diào)整腸系膜淋巴細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL,取出100μL,在每個(gè)流式上樣管中加入100μL準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液,細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè)。標(biāo)記抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25抗體,避光4℃孵育30min。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞,旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1mL的固定/破膜工作液并再次旋渦混勻,避光4℃孵育30min。加入2mL破膜緩沖工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液,直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記Foxp3抗體5μL,避光4℃孵育30min,加入4mL破膜緩沖工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。0.5mLPBS重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測并分析。1.6elisa法測定各組小鼠腸道組織勻漿水平磷酸鈉緩沖液清洗結(jié)腸,處理后的結(jié)腸15000×g離心30min,收集上清,ELISA法測定腸組織勻漿上清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以ue0af±s表示,采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較,采用最小顯著差法檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性。3結(jié)果3.1各組小鼠結(jié)腸長度的比較與TNBS模型組比較,參苓白術(shù)散中劑量組能明顯增加潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度(P<0.05),參苓白術(shù)散高劑量組及地塞米松組能顯著升高小鼠結(jié)腸長度(P<0.01)(如表1)。此組數(shù)據(jù)顯示了參苓白術(shù)散高劑量組在減輕潰瘍性結(jié)腸炎病變程度的潛在作用。3.2各組大鼠腸道il-1、f-和tnf-表達(dá)水平的比較為檢測參苓白術(shù)散能否通過降低腸道炎性細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮腸黏膜保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)檢測腸道TNF-α和IL-1β水平,如表2所示,與模型組比較,參苓白術(shù)散高劑量組與地塞米松組能顯著降低腸道IL-1β水平(P<0.01),參苓白術(shù)散高劑量組能顯著降低腸道TNF-α表達(dá)(P<0.05)。提示參苓白術(shù)散可能通過降低腸道炎性細(xì)胞因子分泌減輕腸道損傷。3.3參茯苓白術(shù)散對小鼠腸道il-10、tgf-的影響有研究報(bào)道潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病與免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)降低有關(guān),CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-10和TGF-β減輕腸道炎癥狀態(tài)。因此,在這部分實(shí)驗(yàn)中,探索了參苓白術(shù)散治療是否可以上調(diào)結(jié)腸組織勻漿中IL-10水平,是否可同時(shí)升高腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞的比例。如表3所示,與正常對照組比較,TNBS模型組小鼠IL-10明顯降低,而與模型組比較,參苓白術(shù)散高劑量組顯著升高了腸道IL-10水平(P<0.01)。為探求參苓白術(shù)散是否通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的比例發(fā)揮治療效應(yīng),我們檢測了腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞與CD4+T比值。結(jié)果顯示與模型組比較,參苓白術(shù)散高劑量組明顯提高腸系膜CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T數(shù)值,見表3。4參茯苓白術(shù)散對資金供應(yīng)的調(diào)節(jié)作用參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,被廣泛應(yīng)用于胃腸道疾病的治療。雖然參苓白術(shù)散多年來應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎,但其具體機(jī)制仍不明了。一些研究認(rèn)為其治療作用與提高大鼠結(jié)腸組織SOD活性,降低MDA水平、降低結(jié)腸炎大鼠吞噬細(xì)胞膜糖蛋白及可溶性黏附分子P選擇素有關(guān)。然而,參苓白術(shù)散與潰瘍性結(jié)腸炎腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系尚未明了。本研究建立TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型,應(yīng)用參苓白術(shù)散進(jìn)行治療,研究顯示參苓白術(shù)散高劑量組通過減輕TNBS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸長度縮短、降低腸黏膜炎性細(xì)胞因子表達(dá)、直接影響腸系膜Treg細(xì)胞比例與功能,調(diào)節(jié)腸道高炎癥狀態(tài)。IL-1β是炎性腸病進(jìn)展的重要介質(zhì)。IL-1β一方面作為抗炎因子介導(dǎo)UC急性期過程,在UC發(fā)生的初始階段發(fā)揮重要活性,另一方面,它還可反饋性的促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2,IFN-γ加速炎癥反應(yīng)。TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生,可使白細(xì)胞在炎癥局部聚集,刺激單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子,最終導(dǎo)致組織的損傷,在UC中被公認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子。在UC活動期,TNF-α水平升高能介導(dǎo)腸黏膜損傷作用。本實(shí)驗(yàn)中,潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道TNF-α與IL-1β水平均升高,增高的細(xì)胞因子與炎癥細(xì)胞相互作用,加重局部腸黏膜的炎癥損傷。經(jīng)過參苓白術(shù)散治療,減輕了TNF-α、IL-1β與炎癥細(xì)胞相互作用,減輕局部腸黏膜的炎癥損傷,從而促進(jìn)腸黏膜修復(fù)與潰瘍愈合。CD4+CD25+Treg對潰瘍性結(jié)腸炎有預(yù)防和治療作用,其功能異?；驍?shù)量減少均可導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生。有效升高Treg比例和加強(qiáng)其功能已經(jīng)成為結(jié)腸炎免疫治療的新策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示參苓白術(shù)散高劑量組明顯升高腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞比例,說明參苓白術(shù)散可能通過提高腸道Treg數(shù)量發(fā)揮腸道黏膜保護(hù)作用。調(diào)節(jié)性Treg主要通過分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明,由Treg誘導(dǎo)的IL-10升高是結(jié)腸炎治療的有效手段。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,與正常組比較,TNBS模型組小鼠腸道IL-10水平明顯降低,其趨勢與Treg細(xì)胞一致,經(jīng)參苓白術(shù)散治療后,腸道IL-10水平水平顯著提高。進(jìn)一步加強(qiáng)了參苓白術(shù)散通過調(diào)節(jié)腸道黏膜Treg及相關(guān)細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮黏膜保護(hù)作用的假設(shè)。同時(shí),這也解釋了為