兩型豆花粉和葉表皮的掃描電鏡觀察

2型大豆（mhicpaeaw.）屬于科豆科，屬于蝴蝶科。這是屬于亞洲、北美和非洲東南部的兩個屬。兩型豆種子可入藥,醫(yī)治婦科病;莖葉可作飼料;地上、地下都結種子,在發(fā)育植物學上有研究價值;兩型豆所含異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌等作用。目前僅見到兩型豆地上、地下種子實生苗發(fā)育特性和不同生境兩型豆果皮和種皮掃描電鏡的比較觀察的報道,本研究首次對兩型豆花粉和葉表皮進行掃描電鏡觀察,旨在為兩型豆的形態(tài)分類學研究、遺傳育種以及應用研究提供花粉和葉的形態(tài)學依據(jù)。1花粉大小測定從河北省青龍縣祖山、秦皇島市燕塞湖自然保護區(qū)陰坡采集自然生長的兩型豆地上、地下種子(分別稱為兩型豆祖山居群和兩型豆燕塞湖居群),分單株收獲保存,在河北科技師范學院農(nóng)學系試驗站田間小區(qū)播種,行距70cm,株距50cm,小區(qū)面積2m×3m,經(jīng)常澆水,保持田間濕潤。幼苗長出第3片真葉時搭遮陽網(wǎng)遮光?；ǚ蹣悠分苽?盛花期,采集兩型豆的花,取其花蕊,光鏡下鏡檢后,將新鮮的花粉直接均勻撒在樣品杯的雙面膠上,在SBC-12型離子濺射儀上濺射,移入KYKY-2800型掃描電鏡觀察、拍照。利用該電鏡的軟件(精度0.01μm)測量花粉大小,以20粒為準,取其最大值、最小值(示變化幅度)和平均值。試驗重復7次。葉表皮樣品制備:采用兩種方法相互補充。(1)間接法:在花期,取植株中部健康、成熟的葉片,用蒸餾水沖洗干凈,分葉基、葉尖、葉緣、葉中部部分,在2.5%戊二醛中固定4.5h,用pH7.3的PBS緩沖液沖洗3次,10min/次,梯度酒精脫水后加入HMDS(六甲基二硅胺烷)液干燥,15min/次,更換2次,吸出多余液體,樣品在空氣中干燥,用雙面膠將樣品粘在樣品杯上,濺射,在電鏡下觀察,拍照。各取5個材料,每個材料觀察5個視野,表皮毛密度和氣孔密度是25個視野氣孔數(shù)的平均值;氣孔大小及保衛(wèi)細胞側壁厚度亦用上述軟件測量,以每個視野2個氣孔共50個氣孔為準,取其平均值。(2)直接法:取植株中部成熟葉片,去塵,于葉片中脈中段與葉緣之間切取2mm×2mm方塊,用雙面膠固定于樣品杯上,直接在電鏡下觀察,拍照。2結果與分析2.12型豆花粉2.1.1兩型豆燕塞湖居群花粉的萌發(fā)溝不明顯,在掃描電鏡下,兩型豆花粉側面觀為近球形至矩球形,極面多為半球形,少數(shù)有凹陷,偶見發(fā)育不良的花粉。兩型豆祖山居群花粉為三孔溝,多數(shù)萌發(fā)溝不明顯(圖版Ⅰ,1),有的為淺凹陷,萌發(fā)孔清晰,多呈圓形,平均直徑為6.20μm,變化范圍為5.35~7.32μm;孔膜由兩個半圓形結構組成,或下陷,或突出,與花粉外表面平齊的孔膜及突出花粉外表面的孔膜多有裂隙。兩型豆燕塞湖居群花粉為三孔溝,萌發(fā)溝明顯(圖版Ⅰ,2),溝長平均為23.74μm,變化范圍為21.67~27.31μm;最寬處平均為6.36μm,變化范圍為4.82~7.70μm。萌發(fā)溝在極面不匯合,將花粉分為三個明顯的溝間區(qū)和溝界區(qū),溝間距離近相等,萌發(fā)孔在萌發(fā)溝最寬處,多數(shù)不易觀察到。因此,兩型豆祖山居群花粉屬于萌發(fā)溝不明顯型,兩型豆燕塞湖居群花粉屬于萌發(fā)溝明顯型。兩個供試材料花粉粒極軸平均長度為32.93μm,兩型豆燕塞湖居群極軸長度的最大值為37.42μm,兩型豆祖山居群極軸長度的最小值為29.37μm。赤道軸平均長度為23.05μm,兩型豆燕塞湖居群赤道軸長度的最大值為23.73μm,兩型豆祖山居群赤道軸長度的最小值為15.52μm?；ǚ蹣O軸與赤道軸之比(P/E)的平均值為1.44,兩型豆祖山居群花粉為1.47,兩型豆燕塞湖居群花粉為1.40(表1)。2.1.2兩型豆燕塞湖居群花粉表土體分析在掃描電鏡下,兩型豆祖山居群花粉外表側面具有疣狀至塊狀突起,溝間區(qū)往往有凹陷,極面有粗網(wǎng)紋。兩型豆燕塞湖居群花粉外表僅有疣狀突起,溝間區(qū)較飽滿,極面亦有粗網(wǎng)紋。因此,兩型豆花粉表面紋飾具有相似性。2.2葉片的表皮特征2.2.1皮質(zhì)膜的制備兩型豆祖山居群和兩型豆燕塞湖居群葉的上、下表皮均有角質(zhì)膜,上表皮表面蠟被呈細網(wǎng)狀(圖版Ⅰ,4),緊貼角質(zhì)膜;下表皮細胞表面蠟被呈棒狀,多層、蓬松(圖版Ⅰ,5、6)。2.2.2牙的形態(tài)兩型豆祖山居群和兩型豆燕塞湖居群葉的上、下表皮細胞形態(tài)均不規(guī)則,犬牙交錯,排列緊密,垂周壁呈波浪狀,外切向壁突出,細胞之間有凹陷,整個葉片表面凹凸不平,容易存留塵埃(圖版Ⅰ,4~8)。葉脈表皮細胞長方形,沿葉脈方向縱向排列(圖版Ⅰ,8),在脈梢處表皮細胞為單列分布。2.2.3表皮細胞及織物形態(tài)兩型豆祖山居群和兩型豆燕塞湖居群葉的上、下表皮均有表皮毛分布,表皮毛均為單細胞非腺毛,基部較粗,末端漸細,大部分橫截面呈圓形,個別為扁形,表面有疣狀突起。非葉脈表皮毛基部有6~12個放射狀排列的表皮細胞(圖版Ⅰ,3、8),葉脈表皮毛基部則無此結構(圖版Ⅰ,8)。從表2可看出,兩型豆葉的表皮毛分布是不均勻的,就葉上表皮而言,兩型豆祖山居群表皮毛密度:葉緣>葉基>葉尖>葉中,兩型豆燕塞湖居群表皮毛密度:葉尖>葉緣>葉中>葉基;就葉下表皮而言,兩型豆祖山居群表皮毛密度:葉基>葉緣>葉中>葉尖,兩型豆燕塞湖居群表皮毛密度:葉緣>葉基=葉尖>葉中。表皮毛分布的總趨勢是葉片邊緣較多于中部,因為表皮毛的主要作用是反射強光,減少蒸騰,所以這種趨勢可能是為了防止葉片邊緣效應,降低蒸騰;下表皮毛平均密度大于上表皮毛平均密度;兩型豆祖山居群上、下表皮的表皮毛平均密度大于兩型豆燕塞湖居群。2.2.4兩型豆祖居群氣孔特征兩型豆祖山居群和兩型豆燕塞湖居群葉表皮的氣孔器僅分布于下表皮,上表皮無氣孔器。氣孔器均呈梭形,下陷,屬平列型,偶見不規(guī)則型。保衛(wèi)細胞外切向壁稀見蠟被,副衛(wèi)細胞的外側垂周壁呈波浪狀(圖版Ⅰ,6、7)。有些氣孔附近有顆粒狀物質(zhì)(圖版Ⅰ,6、10),電鏡下呈白色。保衛(wèi)細胞內(nèi)側壁厚度(兩型豆祖山居群平均值為0.92μm,兩型豆燕塞湖居群平均值為0.89μm)比外側壁厚度(兩型豆祖山居群平均值為0.77μm,兩型豆燕塞湖居群平均值為0.85μm)大,這與一般氣孔特征一致。從表3可看出,兩型豆祖山居群氣孔器(17.86μm×8.23μm)略小于兩型豆燕塞湖居群氣孔器(19.26μm×9.36μm)。兩型豆祖山居群下表皮氣孔密度:葉尖>葉基>葉緣>葉中,兩型豆燕塞湖居群下表皮氣孔密度:葉緣>葉基>葉中>葉尖?？梢?兩型豆下表皮氣孔器分布也不均勻,總的趨勢是,葉邊緣氣孔密度大于葉中部;兩型豆祖山居群下表皮氣孔密度平均值高于兩型豆燕塞湖居群下表皮氣孔密度平均值。2.3兩型豆與不光照兩型豆的形態(tài)關系觀察發(fā)現(xiàn),遮光兩型豆葉片中部上、下表皮特征與不遮光兩型豆基本相似,但是表皮毛密度和氣孔密度均比不遮光兩型豆低(表4),兩型豆燕塞湖居群葉表皮毛基本上分布在葉脈上,這是與弱光環(huán)境相適應的結果。3形態(tài)變異的形態(tài)表現(xiàn)(1)由于花粉在植物個體發(fā)育中出現(xiàn)最晚,生活力保持時間短,且受環(huán)境因素影響較小,故其性狀十分穩(wěn)定,廣泛應用于分類上。根據(jù)實驗結果,兩個供試材料花粉的形狀大小、表面紋飾相似,說明了它們在演化上的近緣性和遺傳上的保守性。兩型豆祖山居群花粉萌發(fā)溝不明顯,而兩型豆燕塞湖居群花粉萌發(fā)溝明顯,這種差異是兩型豆在長期進化過程中適應不同生境所形成的,是穩(wěn)定的,它為不同生境兩型豆的形態(tài)分類提供了依據(jù)。(2)根據(jù)Walker的研究,就花粉表面紋飾的演化趨勢:表面光滑→表面網(wǎng)狀、條紋狀表面→疣狀、刺狀而言,兩型豆花粉表面有網(wǎng)狀、疣狀紋飾,說明兩型豆進化程度較高,形成較晚。從氣孔器來看,普遍認為氣孔器不具副衛(wèi)細胞,開閉能力差或不能開閉的原始;而具副衛(wèi)細胞,保衛(wèi)細胞壁厚度差別大,特化程度高的進化。兩型豆葉氣孔器開閉能力強,具有副衛(wèi)細胞,保衛(wèi)細胞內(nèi)、外側壁厚度差別明顯,亦說明兩型豆進化程度較高。(3)兩型豆祖山居群和兩型豆燕塞湖居群葉表皮毛和氣孔密度的差異以及遮光與不遮光條件下兩型豆葉表皮毛和氣孔密度的差異,都充分說明兩型豆葉的形態(tài)、結構對于環(huán)境的適應。(4)兩型豆葉表面角質(zhì)膜薄,是陰生植物葉的特征。但上、下表皮蠟被的差異、有表皮毛、氣孔下陷的特征有待于進一步研究。另外,氣孔附近的顆粒狀物質(zhì)亦可能是氣孔分泌物。(5)兩型豆氣孔器僅分布于下表皮,而且分布不均勻,總的趨勢是葉邊緣多于葉中部;兩型豆表皮毛分布的總趨勢是葉片邊緣多于中部,下表皮毛平均密度大于上表皮毛平均密度,這些可能都是遺傳因素所致。(6)所采集花粉的發(fā)育階段不同和處理濺射時間的長短都會影響觀察結果?；ǚ鄄杉^早,花粉粒表面仍有許多粘液,粘液往往使花粉粒結塊,不易分離,如果就這樣制樣、觀察,掃描電鏡下花粉粒也就集結成堆,影響觀察結果;采集的花粉也可能發(fā)育不成熟,導致觀察到的有關結果失真?；ǚ鄄杉^晚,花粉活力就下降,制樣后觀察時,圖象發(fā)灰,不易得到清晰的照片。所以,經(jīng)過反復