葡萄酒揮發(fā)性硫化物的研究進展

蒸發(fā)化是一種重要的材料，與葡萄酒的強烈氧化、高活性和低味道閾值有關(guān)。葡萄酒中的揮發(fā)性硫化物可以分為:硫化氫、硫醚、硫醇、含硫雜醇油、硫醇酯、雜環(huán)化合物及果香硫醇。由于檢測手段的限制,長期以來揮發(fā)性硫化物對葡萄酒風味影響的研究相對比較困難,但隨著色譜及質(zhì)譜儀的使用,以及相關(guān)基因技術(shù)手段的應(yīng)用,近幾年國外對于揮發(fā)性硫化物的生物代謝途徑及基因調(diào)控的研究取得了重要進展。1葡萄酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性硫化的變化揮發(fā)性硫化物味覺閾值都很低,它們對于葡萄酒風味的影響具有多樣性,表1列出了葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性硫化物的味覺閾值,及其香氣描述。一些含硫化合物可以構(gòu)成葡萄酒優(yōu)良的風味,如黑莓、黃楊樹、西番蓮、葡萄柚;而另一些則會引起令人不愉快的味道,如臭雞蛋味、大蒜味、煮菜花。2葡萄酒中主要發(fā)育羧酸的生產(chǎn)區(qū)和基因調(diào)節(jié)2.1谷胱甘肽對hs的降解葡萄酒發(fā)酵過程中,釀酒酵母的硫代謝會產(chǎn)生痕量的H2S,能產(chǎn)生令人不愉快的氣味。釀酒酵母可以利用無機硫源(SO42-或SO32-)以及有機硫源(半胱氨酸和谷胱甘肽)來產(chǎn)生H2S。與其他發(fā)酵基質(zhì)(如大麥汁)相比,葡萄醪中無機硫化物的含量較高而有機硫化物的含量較低,然而酵母合成代謝卻需要大量半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸以及谷胱甘肽等有機硫化物。所以,酵母會通過硫酸鹽降解途徑(SRS)利用無機硫化物來合成有機硫化物。在該代謝過程中會產(chǎn)生S2-,進而導致H2S以及其他硫醇類化合物的生成。根據(jù)Swiegers、Linderholm和Kǒnig等人的研究,可將硫酸鹽降解途徑及各基因的調(diào)控位置作個總結(jié)(圖1)。如圖1所示:首先,細胞膜外的SO42-被轉(zhuǎn)sul1,2基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi),SO42-與ATP經(jīng)ATP硫酸化酶(met3編碼)的催化形成腺苷-5-磷硫酸鹽(APS),再經(jīng)APS激酶(met14編碼)的催化下再次磷酸化,形成3-腺苷-5-磷硫酸鹽(PAPS),兩步共需要消耗兩分子的ATP;然后,PAPS在3-腺苷-5-磷硫酸鹽還原酶(met16編碼)的催化下被NADPH2還原,形成SO32-和腺苷3,5-二磷酸,之后SO32-在亞硫酸還原酶多酶復合體(由met5,10編碼)的作用下被NADPH2進一步還原為S2-;最后,當?shù)闯渥愣液线m的時候,S2-在硫化氫解酶的催化作用下,可與O-乙酰-絲氨酸(O-AS)和O-乙酰-高絲氨酸(O-AH)發(fā)生螯合反應(yīng)分別生成半胱氨酸和甲硫氨酸。但是在發(fā)酵初期和中期當?shù)慈狈蛘叻N類不合適的時候(如天冬氨酸含量很少),則不能生成足夠的O-AH和O-AS與S2-結(jié)合進行后續(xù)的反應(yīng),這樣就會使S2-在細胞中聚集,從而以H2S的形式釋放出來。在發(fā)酵的后期酵母能夠利用的氮源和硫源變得非常少,此時液泡中儲藏的谷胱甘肽被分解用于提供酵母代謝所需。谷胱甘肽降解有兩種途徑,即由dug1,2,3聯(lián)合控制的通路以及ecm38(編碼谷氨?；D(zhuǎn)肽酶)調(diào)控的通路,降解產(chǎn)生的半胱氨酸和其他含硫化合物可以分解產(chǎn)生H2S,但機理尚不清楚。有研究顯示,當谷胱甘肽的濃度高于50mg/L時,就會引起H2S產(chǎn)量的升高,進而引起反應(yīng)生成乙硫醇以及硫醇酯。下面介紹一些重要基因在H2S生成過程中的調(diào)控作用。met17編碼O-AH/O-AS硫化氫解酶,其過表達可以引起商業(yè)酵母UCD522菌株中O-AH/O-AS硫化氫解酶活性提高10-70倍,而H2S產(chǎn)量卻沒有明顯減少;但在商業(yè)酵母UCD713菌株中,met17的過表達沒有引起酶活性的改變,但卻使H2S產(chǎn)量大幅度的下降。由此可知,O-AH/O-AS硫化氫解酶的活性與H2S產(chǎn)量并無直接相關(guān)性。然而,met14和ssu1的過表達會引起H2S產(chǎn)量的增加,其原因主要是基于二者分別編碼ASP激酶和亞硫酸鹽的轉(zhuǎn)運蛋白。SO32-降解酶是一個多酶復合體,由met10編碼的α亞基和met5編碼的β亞基組成,該酶是一種血紅素蛋白,需要與其輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核甘酸以及賽羅血紅素結(jié)合。對met10進行定點突變,使得α亞基不能再結(jié)合輔因子,但仍可以和β亞基組成復合體,因此過表達突變的met10編碼的無功能亞基,可以減少H2S的產(chǎn)生。目前,磷酸氫二銨(DAP)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于控制H2S的產(chǎn)生,其原因在于銨鹽可以抑制met10,使α亞基數(shù)量減少,不能組成多酶復合體。有研究表明met17、hom2、hom6、cys4和ser33直接參與含硫氨基酸代謝過程中相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼。其中hom2和hom6是合成O-AH過程中的重要調(diào)控基因,它們的缺乏將導致O-AH生成減少而不能與H2S結(jié)合,從而導致H2S的積累;cys4(編碼胱硫醚β合成酶)是met17的下游基因,調(diào)控同型半胱氨酸與胱硫醚的相互轉(zhuǎn)化,其缺失會導致H2S產(chǎn)量升高,SO42-降解途徑傾向于產(chǎn)生更多的半胱氨酸,所以met6的缺失并不導致H2S產(chǎn)量的增加;而ser33是3-磷酸甘油酸向L-絲氨酸轉(zhuǎn)化第一步的調(diào)節(jié)基因,而且只有第一步的阻斷會導致H2S產(chǎn)量的增加,這不是因為L-絲氨酸產(chǎn)量的減少,而是3-磷酸甘油酸對硫酸鹽降解途徑具有調(diào)節(jié)作用。這5個基因的缺失都將直接導致H2S的產(chǎn)量增加。圖1中其余的基因,可能起到調(diào)控SO42-減少等間接的作用,從而影響酵母的硫代謝。另外,tpo2可以編碼調(diào)節(jié)將乙醛運載出細胞膜的蛋白質(zhì),而乙醛的積累可以促進細胞對谷胱甘肽的需求,進而增強SO42-向H2S的轉(zhuǎn)化。最近的研究報道,通過對H2S高產(chǎn)酵母菌株UCD522與H2S低產(chǎn)酵母菌株P(guān)29在發(fā)酵過程中的基因表達進行實時定量(RT-PCR)檢測,經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn),與硫胺(維生素B1)合成有關(guān)的thi基因在高產(chǎn)菌株H2S中表達水平較高,以此推斷硫胺合成途徑比一般氮代謝對硫化物產(chǎn)生的影響更為重要。2.2甲硫氨酸和丙酮酸的合成甲硫氨酸是硫醇和含硫雜油醇的前體,酵母可以將其轉(zhuǎn)化成甲硫醇、乙硫醇、3-甲硫基戊醇、3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙醛,根據(jù)Landaud等人的研究將釀酒酵母甲硫氨酸生成含硫揮發(fā)性成分的代謝途徑總結(jié)如圖2所示。而酒酒球菌將甲硫氨酸代謝生成3-甲硫基-2-戊醇、3-甲硫基-戊酸、甲硫醇和二甲基硫化物。在釀酒酵母中,甲硫氨酸即可以通過轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)生成4-甲硫基-2-丁酮酸,再經(jīng)裂解生成α-丁酮酸和甲硫醇;還可以直接通過γ-裂解酶直接脫氨基并生成甲硫醇。4-甲硫基-2-丁酮酸經(jīng)過脫羧反應(yīng)生成3-甲硫基丙醛(methional),最后再經(jīng)醇脫氫酶催化反應(yīng)生成3-甲硫基丙醇(methionol)。其中,反應(yīng)中間產(chǎn)物3-甲硫基丙醛只在葡萄酒發(fā)酵結(jié)束之后才能檢測到,并且在陳釀過中含量還會增加,其進一步反應(yīng)可以生成具有蘑菇和大蒜味的乙酸3-甲硫基丙酯。半胱氨酸以及谷胱甘肽的降解也可以產(chǎn)生揮發(fā)性硫醇,例如4-甲硫基-1-丁醇和2-巰基-1-乙醇,都有類似洋蔥、大蒜和家禽、農(nóng)場的味道,但是生成的途徑和參與調(diào)節(jié)的酶,目前尚不清楚。2.3甲基硫醚dms甲硫醇和乙硫醇還可以在葡萄酒釀造過程中進一步氧化成甲基硫醚類化合物,如二甲基二硫醚(DMDS)、二甲基三硫醚(DMTS)都是由甲硫醇生成的,它們是對葡萄酒有不良風味影響的物質(zhì)。二甲基硫醚(DMS)是葡萄酒中對香氣貢獻很大的物質(zhì),賦予干白和甜白葡萄酒以蘆筍、玉米、糖蜜風味,經(jīng)過陳釀的干紅中含有的DMS是引起蘑菇和松露香氣的主要原因,酵母可以利用半胱氨酸和谷胱甘肽而生成DMS,但由酵母和乳酸菌利用甲硫氨酸或甲硫醇生成DMS的途徑尚不清楚。在葡萄酒工藝上,H2S和硫醇可以用CuSO4處理(藍色下膠的方法)來去除,但是由硫醚產(chǎn)生的不良風味卻無法用該方法除去。所以控制甲硫氨酸代謝產(chǎn)生的不良風味物質(zhì),只能通過低產(chǎn)菌株來進行控制,所以含硫氨基酸代謝生成不良揮發(fā)性硫化物的相關(guān)研究,對于控制葡萄酒的風味有重要意義。2.4其他理化性質(zhì)硫代乙酸酯類物質(zhì)是發(fā)酵過程由甲硫醇和乙硫醇與來自氨基酸、游離脂肪酸或糖代謝產(chǎn)生的乙酰輔酶A反應(yīng)生成的,該過程需要酯化酶的催化。H2S生成速度的加快會導致硫代乙酸脂類物質(zhì)的增加,發(fā)酵初期導致硫代乙酸甲酯(MeSAc)含量升高,而發(fā)酵后期導致硫代乙酸乙酯(EtSAc)含量升高。高濃度的H2S和甲硫醇會妨礙酵母的生長,而硫代乙酸酯的產(chǎn)生實際上是一個解毒過程,它將硫化物中含有的一個可抑制酶活性的巰基與乙?；磻?yīng)結(jié)合,從而轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥绊懡湍干L的成分。藍色下膠對硫醇酯類物質(zhì)沒有作用,硫代乙酸脂類物質(zhì)會在葡萄酒的儲藏過程中因化學平衡因素而發(fā)生水解,生成乙酸和硫醇類的化合物。這就是有些葡萄酒在灌裝時并沒有不良風味,但在開瓶時會有不良風味的原因。由此可見,通過對硫醇酯類合成途徑的控制減少硫醇酯在新酒中的積累,對于陳釀過程以及最終葡萄酒風味改善具有重要作用。2.5釀酒酵母中碳-硫裂解酶活性的變化果香硫醇是硫醇的一類,但由于研究較多、實際價值較大常常單獨進行分類。4-甲基-4-巰基-2戊酮(4MMP),3-巰基己醇(3MH)和3-巰基己醇乙酸酯(3MHA)是對于長相思干白和赤霞珠干紅葡萄酒的風味特性有重要貢獻的物質(zhì)。4MMP、3MH和3MHA在葡萄汁中并不存在,它們是在葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。4MMP和3MH是在碳-硫β裂解酶的作用下,從其非揮發(fā)性的前體物質(zhì)——半胱氨酸螯合體(Cys-4MMP,Cys-3MH)中釋放出來的。4個基因被認為對4MMP和3MH的釋放有影響,分別是bna3(調(diào)控煙酸的生物合成)、glo1(編碼乳酰谷胱甘肽裂解酶)、metc(編碼胱硫醚β裂解酶)、cys3(編碼胱硫醚γ裂解酶),但真正調(diào)控釀酒酵母中碳-硫β裂解酶活性的基因依舊尚未確定。另外,大腸桿菌K-12菌株的tnaA基因(編碼色氨酸酶基因,具有半胱氨酸β裂解酶活性)在商業(yè)酵母中的過表達,使酒中4MMP和3MH的含量成為對照組的25倍。研究發(fā)現(xiàn),將改造過的VIN13釀酒酵母菌株應(yīng)用在長相思干白的釀造中,會產(chǎn)生濃郁的西番蓮的熱帶水果香氣。3MHA是在atf1編碼的乙?；D(zhuǎn)移酶作用下由3MH生成的,atf1的過表達可以導致3MHA含量的顯著上升。Iah1編碼酯類降解酶,其過表達會引起3MHA含量的下降。最新的研究發(fā)現(xiàn),果香硫醇的真正前體物質(zhì)可能是谷胱甘肽螯合體。在葡萄酒發(fā)酵過程中,平均只有3.2%的含硫非揮發(fā)性前體物質(zhì),可轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘南銡馕镔|(zhì),這是因為目前使用的釀酒酵母的裂解酶活性有限,所以通過基因工程手段增強酵母碳-硫裂解酶活性是提高特有品種葡萄酒香氣的有效手段。2.6-甲基-3-呋喃硫醇的生成含硫雜環(huán)化合物是伴隨著半胱氨酸的代謝而生成,2-甲硫基呋喃硫醇使葡萄酒具有炭燒咖啡、烤面包和爆米花的香氣,在波爾多紅葡萄酒、由小盲森葡萄釀造的甜酒中可以發(fā)現(xiàn),研究顯示H2S的產(chǎn)量的增加會促進2-甲硫基呋喃硫醇的生成;2-甲基-3-呋喃硫醇及其二硫代物具有濃烈的烤肉味,它們來自于硫胺的水解,在不同酒樣中其含量多可達到100ng/L,在擁有不良風味的葡萄酒中其含量高達300ng/L甚至更多;芐甲基硫醇也是伴隨著H2S生成而產(chǎn)生的,它具有煙熏味和打火石味;噻唑在葡萄酒中具有爆米花和烘烤味,研究表明它也是以半胱氨酸為前體,在酒酒球菌的代謝作用下產(chǎn)生的。在葡萄酒陳釀過程中呋喃硫醇和芐甲基硫醇的含量會有所增加,賦予葡萄酒烘烤類香氣,從而提高葡萄酒香氣的層次感和復雜性,但這方面的研究報道不多,需進一步深入研究。3釀酒酵母含硫活性的基因調(diào)控通過對酵母的篩選和基因改造,使酵母發(fā)酵產(chǎn)生令人愉悅的香氣,同時控制由揮發(fā)性硫化物帶來的不良風味的產(chǎn)生,這是目前國際研究的熱點,國內(nèi)尚無相關(guān)的研究報道。目前的研究存在的問題主要有:首先,關(guān)于H2S代謝的途徑和基因研究的比較多,而硫醇、硫醚以及含硫氨基酸等其他硫化物的基因調(diào)控研究較少;其次,在整個含硫化合物的代謝網(wǎng)絡(luò)中,有關(guān)酶及代謝產(chǎn)物之間的相互關(guān)系研究較少,可以從代謝組學的角度出發(fā),綜合評價某些基因及重要的中間代謝物對整個酵母硫代謝的作用;第三,