分子體外診斷試驗唾液檢驗前過程的規(guī)范提取人類DNAII目 次前言 II引言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1總則 3實驗室外部 4標本采集 4轉(zhuǎn)運要求 6實驗室內(nèi)部 6標本準備 6貯存要求 6唾液DNA的分離 7DNA的定性和定量評估 7DNA的儲存 8參考文獻 9IIIIII引 言DNA唾液越來越多地作為一種替代血液的非侵入性標本來檢測人類DNA。唾液含有微生物和外來物質(zhì)（例如食物殘渣/體外診斷制造商在進行驗證和確認設計時，也需要注意標本的可變性。唾液中的DNA可能會片段化或降解。此外，唾液標本中的細菌也能繼續(xù)生長繼而稀釋人類的DNA。這些細菌分泌的脫氧核糖核酸酶也能加速DNA降解。這些都會可能影響DNA檢測的靈敏度和可靠性。從標本采集到DNADNA降解和唾液采集后的片段化等檢測前因素的影響。本文件包含為獲得高質(zhì)量的唾液標本/樣品和從中分離出用于人類DNA檢測而需要采取的特殊措施。PAGEPAGE1分子體外診斷試驗唾液檢驗前過程的規(guī)范提取人類DNA范圍DNA檢驗的唾液標本的要求和建議。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB19781-2005醫(yī)學實驗室-安全要求（ISO15190:2003,IDT）GB/T22576.1-2018醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012,IDT）WS/T806-2022臨床血液與體液檢驗基本技術(shù)標準WS/T442-2014臨床實驗室生物安全指南WS/T514-2017臨床檢驗方法檢出能力的確認和驗證術(shù)語和定義GB/T22576.1界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。環(huán)境溫度ambienttemperature未經(jīng)調(diào)節(jié)的周圍空氣的溫度。分析物analyte被測量名稱所代表的組分。[來源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]檢驗性能examinationperformance測試待測分析物檢驗的準確度、精密度和靈敏度。注：也包含其他測試性能特性，比如穩(wěn)健性、重復性等。DNA穩(wěn)定劑DNAstabilizers指能盡量減少DNA降解和碎裂的化合物、溶液或混合物。封閉系統(tǒng)closedsystem供應商提供的不可改變的系統(tǒng)，包括分析所需的所有組成部分（即硬件、軟件、程序和試劑）。DNA以雙鏈或單鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合體。檢驗examination以確定一個特性的值或特征為目標的一組操作。注：從分離的分析物開始并包括各種用于定性或定量檢驗的參數(shù)測試或化學操作的過程。檢驗提供者examinationprovider提供特定分析測試的實體。干擾物質(zhì)interferingsubstance能存在于標本中的可能改變檢驗結(jié)果的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)（例如穩(wěn)定劑）。微生物microorganism包括細菌、真菌和原生動物。檢驗前過程pre-examinationprocess分析前階段/檢驗前工作流程：按時間順序從臨床醫(yī)生的申請開始，包括檢驗申請、患者的準備和注：檢驗前階段包括影響預期檢驗結(jié)果的準備流程。原始樣品primarysample為檢驗、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認為可代表全部的一獨立部分的體液、呼出氣、頭發(fā)或組織。能力驗證proficiencytesting利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力。室內(nèi)溫度roomtemperature本文件中是指18℃-25℃注：地方或國家法規(guī)可能存在不同定義。唾液saliva唾液是一種生物液體，主要由三大唾液腺（腮腺、頜下腺和舌下腺）和口腔內(nèi)的唾液腺分泌物組成。唾液采集器salivacollectiondevice用于采集唾液標本的試管或其他容器。樣品sample取自原始樣品的一部分或多部分。穩(wěn)定性stability標本/樣品在特定儲存條件下，在特定時間內(nèi)保持特定屬性值的能力。注：本文件涉及的分析物是所分離的DNA。貯存storage在適宜的條件下長時間中斷樣品、分析物或其衍生物（如染色切片或組織塊）的分析前工作流程，以保持其特性。注：通常在實驗室檔案庫或生物樣本庫中進行長時間貯存。確認validation通過提供客觀證據(jù)對特定的預期用途或應用要求已得到滿足的認定。驗證verification通過提供客觀證據(jù)確認特定要求已得到滿足。注1：“已驗證”一詞用于表明相應的狀態(tài)。注2：認定可能包括以下活動：進行替代計算；比較新的設計規(guī)格與相似的已核實設計規(guī)格；進行測試和示范；以及在簽發(fā)前審查文件。工作流程workflow完成一項工作所需活動的結(jié)構(gòu)化順序?？倓t（包括避免交叉污染B/T256.1或SOIC700。有關(guān)實驗室設備、試劑和消耗品的要求應遵循B/T2761和SOIC020O/S06820387。診斷工作流程的所有步驟都可能影響最終的檢驗結(jié)果。因此，包括生物分子穩(wěn)定性、標本/樣品貯DNA的穩(wěn)定性。性能的驗證以及預期檢驗的確認應考慮到唾液標本質(zhì)量的可變性。設計和開發(fā)唾液DNA實驗時，應進行風險評估（另見ISO14971）。如有需要，應制定消除或減少已確定風險的措施，以確保檢驗工作的順利進行。這部分內(nèi)容應包括審核檢驗前的工作流程步驟。在設計檢驗之前或期間，宜確保檢驗所需的最低DNA含量、大小及純度等人類DNA質(zhì)量參數(shù)，確保其不會影響實驗結(jié)果。關(guān)于標本運送和處理的安全說明應參見GB/T22576.1和GB19781相關(guān)標準。在整個檢驗前過程中，應采取預防措施避免不同標本/樣品之間的交叉污染，例如：處理不同的標本/樣品時，使用一次性的材料（可行時），或是采用適當?shù)那逑闯绦颉Ｋ袡z驗前步驟，應遵循廠家的說明書（如果有）。（例如未能滿足患者的需要在首次使用任何有潛在危險的物料（例如穩(wěn)定劑中的化學品）前，宜詳細閱讀廠家的物料安全資料表。實驗室外部標本采集標本供體/患者信息應包括標本供體/患者的ID，能用編碼的形式。應包括但不局限于：a)標本供體/患者的相關(guān)健康狀況，例如健康狀況、疾病類型、伴隨疾病、人口統(tǒng)計信息（如性別、年齡）；b)采集唾液前的常規(guī)醫(yī)學治療和特殊治療信息，例如麻醉劑、藥物治療；c)所要求的檢查類型和目的；d)標本供體/患者的相應的知情同意。實驗室對唾液采集裝置的選擇（例如由于以往法律要求較松），實驗室應規(guī)定、驗證、確認及記錄唾液采集裝置。不規(guī)范的唾液采集程序、不適當?shù)膬Υ?運送條件和DNA分離程序均可能影響人類DNADNA降解和碎片5.1.4.3患者唾液樣本的采集和穩(wěn)定概述應制定唾液樣本采集方案。唾液標本采集前，應向標本供體/患者提供來自制造商、實驗室或醫(yī)生的書面說明資料。用戶說明宜應包含唾液標本采集的要求和說明。如果沒有的話（例如由于以往法律要求較寬松），應對唾液采集過程進行核實和記錄。采集標本的程序應包括：唾液標本采集、鑒定、儲存及運往實驗室設施的全過程；采集標本前須遵循的規(guī)定，特別是與營養(yǎng)、口腔衛(wèi)生有關(guān)的要求，例如在采集樣本前禁食；采集標本時避免混有咳嗽/咳痰或鼻分泌物（打噴嚏）所產(chǎn)生的黏液。為方便自行采集，樣品患者應配備合適的唾液采集裝置、身份識別標簽（例如標簽、射頻識別（RFID）），以及其他用于采集、貯存及運送標本的所需物品。此外，應為標本供體/患者提供電子的或紙質(zhì)版的唾液標本采集的詳細步驟。采集標本的人能以編碼代稱，根據(jù)GB/T22576.1的要求，應記錄采集唾液的時間和日期。（樣本/標本識別GB/T22576.1（例如二維碼。唾液采集裝置應遵循操作說明，特別是：所需的唾液量；采集唾液后立即搖晃或倒置，使唾液與穩(wěn)定劑混合。注：如果唾液采集裝置中的添加劑與標本沒有均勻混合，那么可能會影響唾液DNA的質(zhì)量和數(shù)量，從而可能影響檢驗結(jié)果的有效性和可靠性。應記錄所有對唾液標本的處理過程。標本供體/患者或從標本供體/患者處采集唾液標本的人應確認與提供的唾液標本采集說明一致。DNA用戶宜應提交經(jīng)過核實的唾液標本采集說明書（例如特定的采集裝置、加入穩(wěn)定劑的樣本等）。（例如由于以前的法律要求較寬松有關(guān)程序需應由實驗室進行指定、/標本供體采集標本前的準備，例如在唾液標本采集前至少30分鐘不要吃、喝、吸煙、親吻或咀嚼任何物質(zhì)。注：使用帶穩(wěn)定劑的采集裝置采集的標本可以適應較長時間的運輸和儲存。DNA如果用戶允許使用不含穩(wěn)定劑的唾液采集裝置，則應為唾液采集提供指定的經(jīng)驗證過的采集說明。如果用戶沒有提供這些說明（例如由于以前的法律要求不那么嚴格），有關(guān)程序應由實驗室進行指定、核實和記錄。實驗室應為使用者提供相應的可行的說明。這些說明宜應包括標本供體/患者采集標本前的準備工作，例如在唾液標本采集前至少30分鐘不能吃、喝、吸煙、親吻或咀嚼任何食物。標本的儲存要求概述對于計劃在生物樣本庫中長期儲存的標本，通常不知道后續(xù)會進行哪項DNA檢驗，因此，為盡量保存DNADNADNA條例在儲存前對DNA的質(zhì)量和數(shù)量進行評估。如果是自行采集，用戶、實驗室或醫(yī)生應向標本供體/患者提供書面的唾液標本存儲說明。標本供體/患者或從標本供體/患者處采集唾液樣本的人員應確認標本是否符合儲存要求。總儲存時間包含上述所述的唾液標本在采集裝置中臨時儲存的時間。制定唾液標本采集的通用規(guī)范。DNA用戶宜應提供經(jīng)過驗證的關(guān)于采集的唾液標本的儲存和運送要求（例如持續(xù)時間、溫度）。（例如由于以前的法律要求不那么嚴格有關(guān)程序應由實驗室進行指DNA（（例如由于以前的法律要求不那么嚴格有即冷凍，在≤-20℃下可儲存3個月，在≤-80℃下可長期儲存。實驗室應核實最長的儲存時間，并按其最短時間進行儲存。不建議在實驗室外使用不含DNA穩(wěn)定劑的采集裝置進行自我采集，貯存條件應記錄在案（即貯存時間及溫度）。轉(zhuǎn)運要求概述用戶需應為采集的唾液標本提供經(jīng)過驗證的可行的運輸條件（例如持續(xù)時間、溫度）。（例如由于以前的法律要求不那么嚴格有關(guān)程序應由實驗室進行指定、核實和記錄。實驗室應為使用者提供相應的可行的說明。（例如溫度記錄器進行溫度監(jiān)控和記錄。如果無法進行記錄，則宜估計并記錄周圍環(huán)境溫度。參見GB/T22576.1相關(guān)條例。DNA如果使用含DNA（即持續(xù)時間和溫度進行（即持續(xù)時間及溫度）。DNA如果使用不含DNA穩(wěn)定劑的唾液采集裝置，同樣應記錄運送條件（即持續(xù)時間及溫度）。如果使用不含DNA5.1.4.320DNA（即持續(xù)時間及溫度）。實驗室內(nèi)部標本準備實驗室應記錄唾液標本//患者或曾向標本供體/患者采集唾液標本的人士的合格確認書。與既定運送程序規(guī)程的任何偏離都應進行記錄，如不符合規(guī)格的標簽和運輸條件、唾液標本體積不足或過量、滲漏/破損、變色器具、不適當?shù)牟少A存要求（（例如由于以前的法律要求較寬松5.1.4和5.2相關(guān)規(guī)定。唾液標本的總儲存時間應包括在唾液采集地點的時間（見5.1.4）、運往實驗室的運輸時間（見5.2）DNA用戶應為唾液DNA的提取提供經(jīng)過驗證的可行程序。為避免DNADNA分離與檢測過程的擴增步驟不應在相同地方進行。如果開發(fā)自動化的DNA分離程序，則應采取措施以避免標本/樣品之間的交叉污染。用戶所選用的DNA提取程序提取的DNA（例如DNA的質(zhì)量和數(shù)量、DNA濃度、DNA長度）。由于唾液標本含有微生物、病毒和食物殘渣，所以分離出來的人類DNA通常會含有微生物DNA和少量來自食物的其他生物DNA。由于唾液標本中的微生物和病毒含量可能在樣本供體/患者之間具有很大的變異性，所以微生物DNA污染的程度也不同，這可能影響人類DNA的定量。一些研究顯示，從含有穩(wěn)定劑的特定采集管采集的每毫升唾液中，總DNA產(chǎn)量（不分人類和非人類DNA）介于0.1微克和26微克之間。在含有穩(wěn)定劑的特定采集管內(nèi)采集的標本，微生物含量中位數(shù)低于漱口水和口腔拭子樣本。與DNA接觸的試劑和消耗品宜是無DNA的。DNA提取性能宜在DNA能力驗證中進行檢測。使用商品化試劑盒如果用戶要求使用市面上某種專用的DNA分離試劑盒，則應嚴格按照試劑說明書進行操作。如果用戶沒有明確要求（例如由于以往較寬松的法律要求），但唾液采集裝置制造商已推薦某一DNA分離試劑盒，實驗室能推薦使用此試劑盒。如果兩者都沒有指定專用的DNA分離試劑盒，實驗室應選擇使用有批文的合適的DNA分離試劑盒。如果可能的話，選擇指定標本/樣品為唾液的DNA分離試劑盒。實驗室應驗證所選試劑盒是否合適。使用實驗室自建的程序如果所有的商用DNA——以唾液為提取標本/樣品修改現(xiàn)有的DNA分離試劑盒提取程序；——使用市售的只用于研究的DNA分離試劑盒；——建立自己的規(guī)程。經(jīng)上述程序選擇并確認的DNA分離程序，實驗室應給出可按照執(zhí)行的具體使用說明。注1：不同的DNA分離程序獲得的DNA片段長度可能不一。此外，DNA數(shù)量和質(zhì)量（例如純度）可能也會有所不同。注2：采用離心、酶或化學液化等方法對粘性標本/樣品進行預處理，能使樣品均勻化，提高核酸的提取效率。注3：穩(wěn)定分子可能會干擾實驗，因此在DNA提取過程種，需要專門的步驟避免DNA穩(wěn)定分子的污染。DNADNA（根據(jù)具體的檢驗測試做選擇）：通過檢測吸光度（A260）或熒光光譜測定量；注：唾液標本的核酸可能含有大量微生物、病毒和食物殘渣的DNA。這些共同構(gòu)成了唾液核酸的總量。因此只能使用特定的實驗（d）對人類的DNA進行定量。通過測量吸光度檢測純度（如：波長掃描、計算A260/A280的比值）；DNA（3’/5’分析或差異長度擴增子比率）；DNA