梔子大黃湯的入血成分及藥效物質(zhì)研究

傳統(tǒng)中醫(yī)通常采用口服給藥法，口服后藥物所含的成分或直接通過胃腸道血液吸收?；蛘咄ㄟ^消化酶、消化酶和腸道內(nèi)菌群的作用，將其分解成二次代謝產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)化為血液?；蛘吒闻K微粒體酶的代謝是活性代謝產(chǎn)物。無論經(jīng)過上述哪一種途徑,其有效物質(zhì)必須以血液為媒介輸送到靶點,才能發(fā)揮相應的藥效,因此,被吸收入血的成分才是中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)。基于以上理論,日本學者田代真一于1988年提出了“血清藥物化學”的概念。近年來,血清藥物化學研究方法引起了眾多研究者的重視,并廣泛將其運用于中藥藥效物質(zhì)基礎研究,顯示出了很好的應用前景。梔子大黃湯(ZhiziDahuangDecoction,ZDD)始載于《金匱要略》,由梔子、大黃、枳實、淡豆豉4味中藥組成,是張仲景治療酒黃疸的經(jīng)典名方,現(xiàn)代臨床應用廣泛,對于酒精性肝炎、黃疸型肝炎、急慢性肝炎、急性胰腺炎、心系重癥等具有確切療效。本實驗室前期利用超快速液相色譜(UFLC)方法建立了ZDD的指紋圖譜,但尚未見有關該方血清藥物化學方面的研究。因此,本實驗在前期體外分析的基礎上,建立ZDD大鼠血清指紋圖譜,初步確定其入血成分及其來源,從而為深入研究ZDD的效應物質(zhì)奠定基礎。1材料表面1.1儀器、試劑和儀器日本島津LC—30ADUFLC色譜儀系統(tǒng),包括二元高壓梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣裝置、SPD—20A型紫外檢測器、柱溫箱,LabSolutions色譜工作站;KQ—250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AB135—S十萬分之一天平(瑞士MettlerToledo儀器有限公司);TGL—16高速臺式冷凍離心機(沈陽杰龍儀器有限公司);XW—80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);MTN—2800D氮吹濃縮儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);VFD—2000真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。1.2藥物、藥物和藥物色譜用乙腈和甲醇均購自美國Fisher公司,色譜用甲酸購自天津市科密歐化學試劑有限公司,水為二次蒸餾水,其他試劑均為分析純。對照品京尼平苷(批號110749-201115)、蘆薈大黃素(批號110795-201007)和大黃酸(批號110757-200206)購自中國食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分數(shù)均大于98%。梔子、大黃、枳實、淡豆豉藥材均購自沈陽天益堂藥店,經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院袁久志副教授鑒定梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實,大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖,枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果,淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品。1.3實驗動物中心提供雄性SD大鼠,清潔級,體質(zhì)量(200±20)g,由沈陽藥科大學實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2010-0001。將實驗動物置于晝夜節(jié)律光照條件下,自由進食進水,室溫在18~22℃,飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境,每日觸摸動物以適應實驗人員的操作。2方法2.1zdd凍干粉樣品的制備參照《金匱要略》原文,折合成現(xiàn)代劑量,按梔子-大黃-枳實-淡豆豉3∶1∶4∶8稱取梔子(GJE)9g、大黃(RPL)3g、枳實(CAL)12g、淡豆豉(SSP)24g,用10倍量水浸泡30min后,回流提取1h,紗布濾過,藥渣加10倍量水重復提取1次,合并2次濾液,經(jīng)冷凍干燥制成ZDD凍干粉樣品,密封置于干燥器中,備用。同法制備5批ZDD凍干粉樣品,編號S1~S5,并計算各批次樣品的出粉率(樣品出粉率=所得凍干粉質(zhì)量/生藥總質(zhì)量)。取ZDD凍干粉0.1g(相當于生藥約0.33g),精密稱定,置50mL具塞碘量瓶中,加甲醇25mL,稱定質(zhì)量,超聲提取30min后,放冷,再次稱定質(zhì)量,并用甲醇補足減失的質(zhì)量,提取液經(jīng)13000r/min離心10min,上清液用0.22μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為體外供試品溶液。另按上述方法分別制備各缺味方及單味藥的凍干粉樣品及其體外供試品溶液。2.2對照品儲備液的制備稱取京尼平苷、蘆薈大黃素和大黃酸對照品適量,精密稱定,分別置于5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得各對照品儲備液;精密吸取各對照品儲備液適量,置于同一10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度分別為京尼平苷500μg/mL、蘆薈大黃素4.1μg/mL和大黃酸9.8μg/mL的混合對照品溶液。2.3單次給藥劑量實驗取ZDD凍干粉適量,加水配成含生藥1.6g/mL的體內(nèi)供試品溶液,同法制備各缺味方和單味藥體內(nèi)供試品溶液(濃度均按照ZDD藥液濃度進行折算)。取雄性SD大鼠,禁食12h(自由飲水),稱體質(zhì)量,隨機分為10組,分別為空白組、ZDD全方給藥組、4個缺味方給藥組和4個單味藥給藥組,ZDD全方給藥組5只,其余各組3只?？瞻捉Mig給予蒸餾水;ZDD全方給藥組分別ig給予由5批ZDD凍干粉樣品制備的體內(nèi)供試品溶液;其余各給藥組分別ig給予梔子、大黃、枳實、淡豆豉、缺梔子、缺大黃、缺枳實和缺淡豆豉方的體內(nèi)供試品溶液。按照1mL/100g單次給藥。各組分別于給藥后1h摘眼球取血,室溫下靜置30min,然后在13000r/min條件下離心3min,取上清液,-80℃冷藏備用。2.4上清液中pahs的測定取血清2mL,加3倍量乙腈,渦旋混合5min,離心(13000r/min)5min,取上清液在氮氣流下吹干(30℃),殘渣加100μL甲醇復溶,超聲3min,渦旋1min,離心(13000r/min)3min,取上清液,備用,供UFLC分析。2.5u3000s-4-硫酸甲酯色譜柱:ShimadzuShim-packXR-ODS(75mm×3.0mm,2.2μm);流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脫:0~8min,5%~8%A;8~21min,8%~17%A;21~24min,17%~18%A;24~33min,18%~40%A;33~38min,40%~90%A;體積流量1.0mL/min;檢測波長254nm;柱溫35℃;進樣量5μL。2.6方法研究2.6.1儀器精密度試驗取同一份ZDD血清樣品供試品溶液,連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.4%,相對峰面積的RSD均小于2.8%,表明儀器精密度良好。2.6.2重復性試驗結(jié)果取同一批次ZDD血清樣品,按上述血清樣品處理方法制備6份供試品溶液,進樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.8%,相對峰面積的RSD均小于3.0%,表明方法重復性良好。2.6.3穩(wěn)定性試驗將同一份ZDD血清樣品供試品溶液,分別于0、2、4、8和12h進樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.6%,相對峰面積的RSD均小于3.0%,表明供試品溶液在測定的12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.7uflc測定取3批ZDD體外供試品溶液,以及5批ZDD血清樣品在相同的色譜條件下進樣分析,建立UFLC色譜圖,比較分析確定入血成分。進而,通過各缺味方、各單味藥體外供試品溶液及其血清樣品的測定,綜合比較分析相應的色譜圖,確定各入血成分的生藥來源。3藥代動力學及活性成分實驗對最佳采血時間進行了考察,分別于ig后0.17、0.5、1、2、3、4h取血,結(jié)果表明,給藥后1h的血清樣品中,ZDD的血中移行成分最多,且各成分色譜峰響應值較高,最適于分析,因此,選定1h為最佳采血時間。通過指紋圖譜的方法研究分析了ZDD的入血成分,結(jié)果表明,大鼠ig給予ZDD后血中出現(xiàn)了21個移行成分(圖1),與體外樣品比較可知,其中9個為體外成分直接吸收入血,即2、7、8、13~15、17~19號峰所對應的成分為ZDD中所含的原型成分,而其他12個成分色譜峰推測為復方原型成分經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化而生成的代謝產(chǎn)物。經(jīng)與混合對照品溶液色譜圖對照可知,原型成分中的2、18、19號峰分別為京尼平苷、蘆薈大黃素和大黃酸。2和13號峰(原型成分)轉(zhuǎn)運入血后的相對含量明顯下降,其原因可能是二者在大鼠體內(nèi)部分代謝轉(zhuǎn)化為其他化學成分,例如,已有報道顯示京尼平苷(2號峰)在腸道β-葡萄糖苷酶的作用下代謝為京尼平;而19號峰(大黃酸)入血后的相對含量則有較大的提高,分析其原因可能是其他蒽醌類成分在體內(nèi)經(jīng)腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化成為大黃酸,其代謝機制尚需進一步探討。此外,ZDD體外樣品中響應較高的原型成分I和II在血清樣品中并未被檢出,推測二者轉(zhuǎn)運入血能力較弱或是在體內(nèi)代謝為其他藥效活性成分。綜合比較ZDD、ZDD缺味方及各單味藥的體外樣品和給藥后血清樣品色譜圖可知(表1):2號峰為梔子所含成分直接入血而形成,20號峰為梔子吸收入血后的代謝成分(圖2、3);15、17~19號峰為大黃所含成分直接入血而形成,10、12、16號峰為大黃入血后形成的代謝產(chǎn)物(圖4、5);6號峰為枳實所含成分入血代謝后產(chǎn)生(圖6、7);7號峰為淡豆豉所含成分直接入血而形成,3~5、11號峰為淡豆豉入血后形成的代謝產(chǎn)物(圖8、9);1、8、13號峰為大黃和枳實共同產(chǎn)生的入血成分;9號峰為大黃和淡豆豉中所含成分入血代謝產(chǎn)生;14號峰為枳實和淡豆豉共同產(chǎn)生的入血成分;21號峰為大黃、枳實和淡豆豉3味藥材共同產(chǎn)生的代謝物。梔子雖為方中主藥,但其對復方血中移行成分的貢獻卻相對較小,分析原因可能一方面是由于梔子所含成分多為極性較大的化合物,血清樣品中受干擾較大,另一方面,推測梔子在ZDD中的作用并非主要依靠自身成分入血來發(fā)揮,而很有可能是通過調(diào)節(jié)其他組成藥味中所含有效成分的溶出及轉(zhuǎn)運入血來發(fā)揮藥效。中藥血清藥物化學研究旨在通過血中移行成