免疫學(xué)技術(shù)知識點總結(jié)免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)：是指在免疫學(xué)長期發(fā)展過程中形成的一套獨特的研究手段和計數(shù)，包括人工免疫防治技術(shù)（疫苗和血清）和免疫檢測技術(shù)（抗原抗體檢測和機體免疫功能檢測）免疫學(xué)研究涉及到的重要技術(shù)包括：單克隆抗體技術(shù)、T細胞克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)、分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等。第一章免疫學(xué)概論疾病是指在集體受到致病因子的作用下，因自穩(wěn)調(diào)節(jié)紊亂而引發(fā)的一系列異常生命活動的過程，表現(xiàn)出一系列代謝、功能、結(jié)構(gòu)的變化，有癥狀、機體的一系列病變。引起疾病的因素：生物性因素：病原微生物、髕骨、細菌等理化性因素：機械力、溫度、強酸、強堿、電離輻射等營養(yǎng)性因素：主要是指包括生物大分子在內(nèi)的會對機體的生命活動有一些影響的因素。遺傳性因素：包括染色體畸變在內(nèi)的遺傳因素先天性因素：能夠損害胎兒的有害因素。免疫因素：超敏反應(yīng)、自身免疫疾病、免疫缺陷病。精神性疾病免疫是指機體免疫系統(tǒng)識別自己和異己并且通過免疫應(yīng)答排除異己，以維持機體生理平衡穩(wěn)定的功能。Qwen發(fā)現(xiàn)了血型鑲嵌模型Medarwar發(fā)現(xiàn)了免疫耐受是可以通過人工誘導(dǎo)的Burnet形成了抗體的克隆選擇學(xué)說，具體內(nèi)容與如下：機體內(nèi)存在一些可以識別多種抗原的細胞系并且這些細胞系在細胞表面具有識別抗原的受體?？乖M入體內(nèi)后，選擇相應(yīng)的受體的免疫細胞使之活化、繁殖，最后成為免疫活性細胞及免疫記憶細胞。胚胎時期自身抗原與免疫細胞相接觸就會被破壞、排除或者處于抑制狀態(tài)，銀支撐位失去對自己抗原的反應(yīng)性，也就是形成了自身免疫耐受，這種排除或者受抑制的細胞系成為禁忌細胞系。免疫細胞系可以突變成為能與自身抗原反應(yīng)的細胞系，因此生為自身免疫反應(yīng)。也就是禁忌細胞系重新被激活并且與自身抗原發(fā)生反應(yīng)成為自身免疫病。自身：胚胎發(fā)育早期接觸過的抗原。異己：發(fā)育早期沒有基礎(chǔ)過的抗原。免疫的本質(zhì)就是識別自己排除異己。免疫應(yīng)答是機體免疫系統(tǒng)對自身和異己的識別和反應(yīng)，并且排除異己保護自己的過程。免疫應(yīng)答可以分為兩類：固有免疫和適應(yīng)性免疫（體液免疫和細胞免疫）。三大免疫功能：免疫監(jiān)視、免疫防御、免疫自穩(wěn)。四種免疫能力：識別、反應(yīng)、調(diào)節(jié)、記憶。病原體侵入的過程啟動免疫過程分別是：即刻固有免疫應(yīng)答：防御屏障、固有免疫細胞、固有免疫分子誘導(dǎo)性免疫應(yīng)答：炎癥反應(yīng)、效應(yīng)細胞的招募和活化。適應(yīng)性免疫：病原體進入——初始的T、B細胞識別抗原。固有免疫是指：由巨噬細胞等固有免疫細胞固有免疫免疫分子組成，主要通過受體與配體之間的識別非特異性的區(qū)別自己和非己。主要特點是：非遺傳性、非特異性、無記憶性。適應(yīng)性免疫是指通過T、B細胞介導(dǎo)的。通過抗原抗體的特異性結(jié)合來區(qū)別自己和非己的免疫，特點在于遺傳性、特異性、記憶性、多樣性和放大性。免疫防御是指機體通過免疫應(yīng)答防御和清除各種病原體的侵襲，以維持機體的健康狀態(tài)，也表現(xiàn)在排斥異種或者同種異體的器官。主動免疫：機體自己產(chǎn)生的免疫力稱為主動免疫，其中有病毒、細菌等感染之后形成的叫做天然主動免疫、由于人工接種細菌等病原體產(chǎn)生的免疫叫做人工主動免疫。被動免疫：輸入現(xiàn)成的免疫力：其中母乳喂養(yǎng)等屬于天然被動免疫，接種抗體（血清）等屬于人工被動免疫。疫苗：凡是具有抗原性、接種到機體之后產(chǎn)生特異性主動免疫，并且可以低于傳染病發(fā)生的制劑統(tǒng)稱為疫苗。巴斯德的三種疫苗：雞霍亂病毒疫苗、狂犬病疫苗、炭疽桿菌疫苗。泰勒的雞胚減毒疫苗。人乳頭瘤病毒疫苗免疫防御功能異常會出現(xiàn)免疫防御功能底下會導(dǎo)致免疫缺陷。免疫防御功能過強會導(dǎo)致過敏反應(yīng)。超敏反應(yīng)是指在集體再次接觸到相同抗原時，，發(fā)生的免疫功能紊亂或者免疫組織損傷的特異性免疫應(yīng)答的反應(yīng)。超敏反應(yīng)可以分為四種：I型超敏反應(yīng)：過敏反應(yīng)II型超敏反應(yīng)：細胞溶解型III型超敏反應(yīng)：免疫復(fù)合物型（小分子可溶性復(fù)合物、中等大小可溶性復(fù)合物、大分子不溶性的復(fù)合物）IV型超敏反應(yīng)：細胞介導(dǎo)型免疫監(jiān)視是指免疫系統(tǒng)可以監(jiān)視和識別體內(nèi)突變的細胞，防治腫瘤發(fā)生。免疫功能如果未及時發(fā)現(xiàn)會出現(xiàn)突變細胞的異常增殖，形成腫瘤?？鼓[瘤免疫應(yīng)答：機體抗腫瘤的效應(yīng)包括體液免疫和細胞免疫。腫瘤的免疫逃逸機制免疫自穩(wěn)：是指機體借助于免疫系統(tǒng)內(nèi)部的自控調(diào)節(jié)機制，消除衰老和損傷的細胞，清楚代謝等產(chǎn)生的廢物，以維持機體內(nèi)部的生理平衡和穩(wěn)定。免疫自穩(wěn)異常會出現(xiàn)不能及時清除衰老死亡的細胞核代謝廢物，導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境失調(diào)。免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失調(diào)，對自身組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)，則發(fā)生自身免疫病。也就是說，自身免疫病是由于免疫自穩(wěn)不能正常調(diào)節(jié)引起的，超敏反應(yīng)是由于免疫防御過強導(dǎo)致的。自身免疫：機體對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答，存在與所有個體，是機體免疫子文的重要組成部分，通常情況下不會對集體造成損傷。自身免疫病是由于機體對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答導(dǎo)致的免疫性疾病狀態(tài)。（多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關(guān)節(jié)炎）免疫平衡是健康的核心。識別功能：免疫系統(tǒng)通過細胞表面的受體對抗原的辨認，是免疫應(yīng)答的前提和基礎(chǔ)。反應(yīng)功能：免疫系統(tǒng)在識別抗原的基礎(chǔ)上，啟動免疫應(yīng)答，清除異物以及衰老損傷的細胞和廢物，使機體內(nèi)部的生理環(huán)境穩(wěn)定，也會出現(xiàn)病理狀態(tài)。調(diào)節(jié)能力：免疫系統(tǒng)對應(yīng)答強度的自我感知能力和反饋能力。記憶功能：免疫系統(tǒng)再次遇到相同的抗原時，會出現(xiàn)第二次增強的免疫應(yīng)答，成為免疫系統(tǒng)的記憶功能，是適應(yīng)性免疫的重要特征之一。固有免疫的識別方式：病原體相關(guān)分子模式的識別方式（PAMP）：許多病原體共有的，進化上相對保守的分子結(jié)構(gòu)，在正常宿主細胞表面不表達，因而成為固有免疫識別的靶位。比如說LPS、肽聚糖、病毒雙聯(lián)RNA等。模式識別受體（PRR）：固有免疫對其進行識別和結(jié)合的受體（清道夫受體、甘露糖受體）。損傷相關(guān)分子模式的識別方式（DAMP）：各種原因?qū)е挛鲏螕p傷出現(xiàn)某種物質(zhì)比如說凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸、損傷壞死細胞表面的HSP等，與模式識別受體結(jié)合，激活免疫細胞，屬于內(nèi)源性危險分子。對喪失自我的識別方式：NK細胞表面的抑制性殺傷細胞免疫球蛋白手提找不到相應(yīng)的HLA-I類配體就會發(fā)生活化，殺傷靶細胞。適應(yīng)性免疫（對抗原特異性識別）反應(yīng)能力：免疫系統(tǒng)在識別抗原的基礎(chǔ)上啟動免疫應(yīng)答，清除異物或者衰老、受損的細胞，是集體達到生理平衡的狀態(tài)，也可能會出現(xiàn)病理狀態(tài)。適應(yīng)性免疫應(yīng)答的類型：體液免疫：B細胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)，主要由抗體介導(dǎo)，因此成為體液免疫。細胞免疫：T細胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)，主要由效應(yīng)T細胞介導(dǎo)。因此，叫做細胞免疫?？贵w介導(dǎo)的免疫效應(yīng)：中和反應(yīng)、免疫調(diào)理、免疫溶解、街道細胞毒性作用T細胞街道的免疫應(yīng)答：Th細胞細胞街道的免疫應(yīng)答和CTL細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。調(diào)節(jié)能力：免疫系統(tǒng)對應(yīng)答強度的自我感知及反饋調(diào)節(jié)。免疫調(diào)節(jié)是指在免疫應(yīng)答過程中免疫細胞和免疫分子相互作用形成正負調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并在遺傳基因控制以及神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的參與下維持機體的平衡和穩(wěn)定。作用：提高機體的免疫力，排出異物減少對自身組織的損傷抗原清除之后，及時終止免疫應(yīng)答。分子水平的免疫調(diào)節(jié)：抗原對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、抗體對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、抗體獨特型免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、補體對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、細胞因子對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。細胞水平的免疫調(diào)節(jié)：B細胞對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、T細胞對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、NK細胞對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、巨噬細胞對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、細胞凋亡對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。整體和群體水平的免疫調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說：抗原在進入機體之前，機體內(nèi)處于一種相對的免疫穩(wěn)定狀態(tài)；抗原進入機體之后，打破了這種平衡；當抗體達到一定量之后，將引起抗體獨特型抗體的產(chǎn)生；抑制增值的克隆，防止其無休止的增殖，用于維持免疫應(yīng)答的穩(wěn)定。具有多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性。神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)解網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)系統(tǒng)：神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)內(nèi)分泌系統(tǒng)：激素少數(shù)為增強免疫應(yīng)答的激素（生長激素、催產(chǎn)素、甲狀腺素）免疫系統(tǒng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響：受細胞因子影響的中樞性介導(dǎo)活動“促進神經(jīng)細胞生長、增殖分化和存活；炎癥。睡眠，行為。受細胞因子影響的外周性介導(dǎo)活動：甲狀腺功能記憶能力：同一張抗原再次出現(xiàn)的時候，免疫系統(tǒng)會有記憶功能。第二章

抗體制備技術(shù)抗體的基本概念：多克隆抗體（多個淋巴細胞克隆所分泌的抗體）和單克隆抗體（單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體）單克隆抗體的特點：高度均質(zhì)（同一亞類），化學(xué)組成均一，不含或很少含Ig特異性強，只針對某一種抗原表位親和力強抗原用量少，無須純化無批間差異來源穩(wěn)定，可達批生產(chǎn)，容易標準化不易形成沉淀線操作比較麻煩什么條件下需要制備單抗：目的蛋白有類似的結(jié)構(gòu)抗原不純，無法分開多抗的效果不好（已經(jīng)排除非特異性反應(yīng)）希望將抗體用于治療，研制成藥物希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑。第一節(jié)多克隆抗體的之別一、多克隆抗體制備的原理抗體制備、動物免疫、抗體純化二、多抗的基本條件1.免疫原的制備顆粒性抗原：細胞、病毒、細菌等，一般具有較強的免疫原性，可以不加佐劑，直接進行腹腔注射?？扇苄钥乖嚎扇苄钥乖膩碓粗饕翘烊患兓蛘哂媚康幕蛟谠思毎蛘哒婧思毎斜磉_，可溶性抗原需要與弗氏佐劑完全或不完全混勻，才可以進行免疫。（1）完全抗原的提取：細胞破碎法、抗原提取、抗原的純化（2）半抗原與載體的交聯(lián)：載體的選擇、半抗原與載體偶聯(lián)的方法、偶聯(lián)復(fù)合物的鑒定（3）合成肽抗原：免疫原性肽的選擇、肽的合成和純化2.免疫動物的選擇：3.佐劑的準備：佐劑的種類：無機佐劑、有機佐劑、合成佐劑、油劑三、多克隆抗體制備的基本方法1.抗原計量、免疫途徑與免疫日程免疫動物的方法：免疫原值被：無佐劑免疫法：適用于顆粒性抗原弗氏佐劑免疫法：適用于可溶性抗原鋁佐劑免疫法：適用于人的免疫免疫動物（一般選擇雌性動物，溫順并且可以生產(chǎn)）皮內(nèi)免疫法皮下或肌肉免疫法淋巴結(jié)免疫法混合法抗體效價滿意后靜脈注射加強免疫常見的注射方法；皮下注射、皮內(nèi)注射、尾靜脈注射、靜脈注射2.小樣試血與采血抗血清的獲得：眼眶取血、頸動脈放血、心臟采血免疫效果評價：取血（兔耳動脈、鼠尾靜脈）、檢測（雙向免疫擴散、ELISA）3.抗體的分離和純化技術(shù)鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析、親和層析法、電泳分離法親和層析法原理：利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合（抗原-抗體、受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合，捕捉與他相配的物質(zhì)，洗脫另外一種物質(zhì)，并且洗脫一般用改變pH的方法。主要步驟：將蛋白質(zhì)與活化柱子結(jié)合，將腹水或者血清處理后過柱子，用結(jié)合緩沖液洗柱子（知道A280為零），永安氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液，測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品。4.抗體的鑒定蛋白質(zhì)濃度的測定：紫外分光比色法、雙縮脲法、福林酚法、免疫效果評價：雙向免疫擴散、ELISA純度分析：免疫印跡（WB）抗體類別分析：免疫金試條親和力分析：ELISA、熒光偏振5.抗體的保存抗體的濃縮：吸收、蒸發(fā)、超濾抗體的保存：濃縮抗議+甘油+防腐劑免疫效果不佳的原因可能是：抗原純度不夠、免疫原性低、免疫途徑乳化不合格、免疫劑量不合適、動物疾病或者種屬差異小。第二節(jié)單克隆抗體制備技術(shù)一、單克隆抗體制備的原理1個B細胞只能產(chǎn)生1個抗體。方法是細胞工程雜交技術(shù)和B細胞雜交瘤技術(shù)需要將單克隆B細胞和腫瘤細胞相結(jié)合才可以永久產(chǎn)生單抗Barski等發(fā)現(xiàn)細胞額自然融合現(xiàn)象，但是頻率很低岡田等發(fā)現(xiàn)滅火的仙臺稟賦和聚乙二醇能顯著提高細胞融合的效率。二、單抗制備的基本條件需要培養(yǎng)正常的B細胞以及B細胞融合的腫瘤細胞1.動物的免疫抗原與載體、動物的選擇、免疫途徑舉例：小鼠免疫第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑——小鼠背部皮下注射（4周后）第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑——小鼠背部皮下注射（3周后）第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（10天后檢測血清效價）加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（3天后）細胞融合2.酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養(yǎng)細胞DNA合成途徑：次黃嘌呤（H）通過嘌呤合成跑路途經(jīng)合成HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）進一步合成鳥嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）通過嘧啶合成旁路途經(jīng)合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），進一步合成胸腺嘧啶脫氧核苷酸氨基酸、谷氨酰胺、鳥核苷單磷酸通過核酸生物合成主要途徑結(jié)合上面兩步合成的鳥嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脫氧核苷酸形成DNA將第三步當中氨基端變?yōu)榘被剩ˋ），則無法形成DNA。因此酶缺陷型細胞的篩選就是HAT篩選3.單抗檢測方法的建立免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)免疫擴散技術(shù)三、單抗制備的基本方法1.酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養(yǎng)組織培養(yǎng)的基本條件：儀器：包括CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺、液氮罐、低速低溫離心機試劑：培養(yǎng)液、HAT選擇培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、血清、抗生素耗材：培養(yǎng)板、培養(yǎng)品、吸管、移液管骨髓瘤細胞系的選擇要點：（1）所選的骨髓瘤細胞應(yīng)與提供免疫脾細胞的動物品系相同（2）自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈和輕鏈（3）對氨基碟呤敏感（4）與免疫脾細胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌的Ig雜交細胞2.飼養(yǎng)細胞的制備飼養(yǎng)細胞的作用：（1）增加細胞濃度，滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的要求（2）吞噬清楚死亡的細胞（3）分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長飼養(yǎng)細胞的種類和制備方法（1）小鼠腹腔巨噬細胞（2）小鼠脾細胞（3）成纖維細胞3.脾細胞的分離（1）拉頸椎處死小鼠（2）無菌操作取出脾臟（3）清洗、研磨（4）收集細胞（5）離心洗滌（6）細胞計數(shù)4.細胞融合：骨髓瘤細胞和脾細胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融劑PEG細胞融合的方法：PEG融合、仙臺病毒、電融合5.HAT選擇性培養(yǎng)HAT選擇性培養(yǎng)的原理：細胞的DNA生物合成右主要途徑和補償途徑。當A存在是，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，須通過補償途徑合成DNA，這時就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。由于選用西黃嘌呤鳥嘌呤荷塘轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在細胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）細胞作為親本，該校只能通過群全條件的DNA培養(yǎng)基才可合成，因此雜種細胞通過互補作用獲得HGPPT或者TK基因。只有雜種細胞可以活，酶缺乏性細胞完全無法存活，單克隆B細胞一般不能長期生長，就起到了分離雜交細胞的作用。細胞生長情況：融合3-4天之后，可以看到刑訴骨髓瘤細胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。篩選后存活的細胞就是脾細胞和骨髓瘤細胞融合細胞。6.陽性克隆的篩選分泌單克隆抗體雜交瘤細胞的檢測方法免疫酶技術(shù)：簡介ELISA法免疫熒光技術(shù)：間接免疫熒光測定法、流式細胞分析技術(shù)（陰性對照：骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清，陽性對照：免疫鼠血清）7.克隆化培養(yǎng)：陽性細胞的單克隆化克隆是指由單個細胞繁殖、擴增而形成的性狀均一的細胞集落的過程。常見方法有：有限稀釋法和軟瓊脂克隆技術(shù)有限稀釋法：從陽性分泌孔收集雜交瘤細胞。軟瓊脂克隆技術(shù)：從陽性分泌孔中收集雜交瘤細胞，一適當濃度雜交瘤細胞加入到軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成有一個細胞增殖來的細胞集群。單克隆抗體的鑒定：（1）抗體敏感性檢測：對腹水和培養(yǎng)基上清進行效價測定（2）抗體特異性鑒定：是否與其他抗原右交互反應(yīng)。（3）抗體效價測定（4）抗體亞類鑒定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM（5）抗體親和力鑒定（6）識別表位分析8.單克隆抗體的擴大生產(chǎn)：細胞培養(yǎng)法、小鼠體內(nèi)誘生法、生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)法：雜交瘤細胞、培養(yǎng)瓶或罐中培養(yǎng)、收集上清液、純化抗體動物體內(nèi)誘生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液體是啦或降植烷、腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞、收集腹水生物反應(yīng)器：發(fā)酵罐培養(yǎng)單抗培養(yǎng)常見的問題：（1）污染：培養(yǎng)環(huán)境、操作（2）融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養(yǎng)基（3）抗體分泌不足：支原體污染、細胞突變、培養(yǎng)體系有問題（4）雜交瘤細胞難以克隆化：血清質(zhì)量、細胞活性第三節(jié)基因工程抗體制備技術(shù)基因工程抗體：通過基因工程的手段，按照個人意愿進行細胞人工改造的技術(shù)。優(yōu)點主要有：特異性高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉、工藝簡單、異源性滴低、穿透性好、功能豐富。一、鼠源抗體人源化鼠源抗體應(yīng)用中的障礙：免疫原性、半衰期短、抗體功能片段失活。1.嵌合抗體：可變區(qū)基因克隆、表達載體的構(gòu)建、嵌合抗體的表達2.改型抗體二、小分子抗體：Fab抗體、Fv抗體和單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位小分子抗體的優(yōu)點：（1）可在原核體系中表達，降低生產(chǎn)成本。（2）因為其分子量小，穿透能力強，易進入病灶部位，有利于對腫瘤等疾病的治療。（3）不含F(xiàn)c片段，不與Fc受體結(jié)合，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的不利影響。（4）在體內(nèi)半衰期短，有利于體內(nèi)毒性物質(zhì)的消除（5）易于進一步基因工程分改造。三、]基于抗體的應(yīng)用1.CAR-T免疫治療：CAR-T免疫療法：即嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是一種新型的過繼性細胞療法，即利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞的細胞療法，并非藥物。CAR-T技術(shù)：通過整個嵌合抗原受體的經(jīng)過基因修飾的T細胞抵抗腫瘤細胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原，識別結(jié)合后將激活及增值信號傳遞到T細胞內(nèi)，引起T細胞激活，增殖釋放細胞因子，從而殺傷腫瘤細胞。2.免疫檢查點3.免疫毒素4.ADC5.雙特異性抗體第四節(jié)[endif]抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)：即用基因克隆技術(shù)將全套抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達載體上，通過原核系統(tǒng)直接表達有功能的抗體分子片段，并篩選出特異性的抗體分子和可變區(qū)基因。一、噬菌體展示技術(shù)原理：噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白質(zhì)或者DNA序列查到噬菌體外殼上的適當位置，使外源基因隨著外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨著噬菌體的重新組裝而展現(xiàn)倒是菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，人們已經(jīng)靠發(fā)出單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)等。二、噬菌體抗體制備的基本程序1.收集淋巴細胞提取mRNA并轉(zhuǎn)錄到cDNA或直接提取斯堡基因組的DNA2.擴增DNA的抗體可變區(qū)基因3.[構(gòu)建重組噬菌體庫4.篩選所需特征的重組噬菌體5.采用突變或鏈置換使親和力成熟三、噬菌體抗體技術(shù)的特點1.篩選步驟簡單、快速、有效2.擴大了篩選流量，一次就可以篩選多于1010個的克隆3.抗體基因型與表現(xiàn)性聯(lián)系密切，基因穩(wěn)定且容易改造4.模擬天然免疫系統(tǒng)親和力成熟過程5.無需人工接種6.可替代動物多克隆抗體7.構(gòu)建康體苦時。輕重鏈可變區(qū)基因在體外隨機組合，可產(chǎn)生體內(nèi)部存在的輕重鏈組合，得到新的特異性抗體。8.可以在預(yù)案和系統(tǒng)中表達，大規(guī)模生產(chǎn)方便，且成本低。四、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用1.制備全人源抗體2.改良基因工程抗體第三章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)第一節(jié)

沉淀反應(yīng)一、沉淀反應(yīng)的原理沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在溶液或者凝膠中特異性結(jié)合后，如果兩者比例合適，可相互作用形成不溶性的免疫復(fù)合物，出現(xiàn)肉眼可見的不溶性沉淀物。（比例合適時，由分子熱運動引起。）二、沉淀反應(yīng)的類型（一）溶液中的沉淀反應(yīng)是指在清澈透明的特異當中，呈現(xiàn)溶解狀態(tài)的抗原與抗體在試管內(nèi)或凹薄片上混勻，可凝聚成為肉眼可見的須狀或顆粒狀的不溶性物質(zhì)。溶液中沉淀反應(yīng)有：1.絮狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀法就是指將抗原與抗體相結(jié)合之后在適當?shù)碾娊赓|(zhì)存在條件下，抗原抗體形成肉眼可見的絮狀沉淀物。特點：方法受抗原抗體比例的影響顯著；應(yīng)用于測定抗原抗體反應(yīng)的合適比例上。絮狀沉淀法的三種方法：抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例2.環(huán)狀沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀法是又叫毛細管內(nèi)沉淀反應(yīng)，是常見的一種檢測抗原抗體濃度的方法。在毛細管內(nèi)，上面是抗原，下面是抗體，中間有一道平衡區(qū)即為沉淀，但假如不同種抗原或者抗體之后，就會發(fā)現(xiàn)不同濃度的抗原抗體所形成的環(huán)狀沉淀位置不同?？乖瓭舛仍礁撸贵w濃度越低，出現(xiàn)的的沉淀越接近管底部。1.免疫比濁法免疫比濁法的基本原理是：當抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適時，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。優(yōu)點在于：矯正曲線穩(wěn)定、簡便快速、已與自動化、沒有放射性核素污染。缺點在于靈敏度差，特異性較差。免疫比濁法的分類：透射比濁法、散射比濁法、免疫膠乳濁度測定法、速率抑制免疫比濁法2.免疫沉淀技術(shù)（經(jīng)典免疫學(xué)沉淀技術(shù)）加入特異性抗體、沉淀試劑形成混合抗原，離心沉淀之后沉淀抗原，經(jīng)過電泳分離之后放射自顯彰。3.免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)的原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當用預(yù)先固化在argarosebeads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。優(yōu)點在于：1.可以檢測細胞內(nèi)相互作用蛋白質(zhì)的天然活性，2.檢測證實細胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)相互作用，3.獲得天然狀態(tài)下的相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。免疫共沉淀的局限性在于：1.難以檢測低親和力和短暫的相互作用。2.不能確切的分辨第三種蛋白的橋聯(lián)作用。3.靈敏度不如親和色譜高。4.需要對未知蛋白有一定新的了解。免疫沉淀的應(yīng)用范圍：應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對含量的測定，蛋白質(zhì)修飾水平等分析，蛋白質(zhì)相互作用的研究。（二）凝膠中的沉淀反應(yīng)1.單向免疫擴散實驗：在瓊脂糖中加入抗體，形成抗體凝膠，抗原加入后，抗原根據(jù)濃度大小自由擴散，與抗體形成沉淀環(huán)，抗原濃度越大，沉淀環(huán)越大。2.雙向免疫擴散試驗：抗原抗體都會發(fā)生擴散，但兩者相互擴散形成沉淀線之后就表示出了濃度，形成的沉淀線離抗原越近，說明抗原的濃度越大。3.免疫電泳：免疫電泳法是將抗原樣品在瓊脂平板上先進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開，然后加入抗體做雙相免疫擴散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而使其相遇，在二者比例適當?shù)牡胤?，形成肉眼可見的沉淀弧。多用來分析抗原比較復(fù)雜的抗原復(fù)合物。4.火箭電泳試驗：凝膠含有抗體，叫抗原跑膠之后形成峰值，峰值越高，說明抗原濃度越高。5.免疫印跡技術(shù)：WB將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離,然后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下,使凝膠中的單一抗原組份轉(zhuǎn)移到印跡紙上,并且固相化。最后應(yīng)用免疫覆蓋液技術(shù)如免疫同位素探針或免疫酶探針等,對抗原固定化基質(zhì)膜進行檢測和分析。第二節(jié)

凝集反應(yīng)一、凝集反應(yīng)原理凝集反應(yīng)：顆粒型抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適當電解質(zhì)純愛下，形成肉眼可見的凝集團塊。凝集原和凝集素凝集反應(yīng)的特點：1.凝集反應(yīng)中抗原顆粒較大，長期浸漬或者沉淀可以自然沉降。2.凝集反應(yīng)中凝集塊主要由抗原組成，沉淀反應(yīng)中沉淀塊主要有抗體組成。3.在您肌膚那英中，需要稀釋免疫血清中的抗體，是抗體不至于過多；而在沉淀反應(yīng)中，為了防止抗原過多們一般都會稀釋抗原（即沉淀反應(yīng)中的抗體過量，凝集反應(yīng)中一般都是抗原過量）二、凝集反應(yīng)的類型1.直接凝集反應(yīng)：是將細菌或紅細胞與其相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細菌凝集或者紅細胞凝集。（1）微生物凝集反應(yīng)：肥達式反應(yīng)，用已知的傷寒桿菌O、H抗原與甲乙型副傷寒桿菌H抗原，與病人的血清做定量凝集試驗，一測定患者血清中無相應(yīng)抗體的存在，作為傷寒、副傷寒的診斷參考。（2）同種紅細胞凝集反應(yīng)：血型檢驗2.間接凝集反應(yīng)：將可溶性抗原（或抗體）包被在不溶性顆粒表面，與響應(yīng)抗體（或抗原）在適宜條件下結(jié)合形成凝集團塊。反應(yīng)類型：（1）正向間接凝集反應(yīng)：將抗原先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。（2）反向間接凝集反應(yīng)：將特異性抗體先結(jié)合在載體表面，然后與相應(yīng)的抗原發(fā)生凝集反應(yīng)。（3）間接凝集抑制反應(yīng)：先將可溶性抗原（或抗體）與相應(yīng)的抗體（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗體）致敏的載體顆粒，若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則說明標本中不存在相同抗原，抗體試劑未被結(jié)合。3.橋梁凝集反應(yīng)：也就相當于二抗