苦瓜水提物和山梨酸鉀對(duì)幾種食品污染微生物的抑菌活性比較

食品保藏期的延長(zhǎng)和食品品質(zhì)的保證起著非常重要的作用。腐爛保鮮劑是食品工業(yè)中最重要的食品添加劑之一。傳統(tǒng)的食品防腐保鮮劑主要是化學(xué)合成品,由于合成防腐保鮮劑可能存在毒性和致癌的問題,在許多國家已被逐步禁止或限制使用。國際上食品添加劑朝無毒、安全、天然方向發(fā)展已形成趨勢(shì)。因此,評(píng)價(jià)和篩選具有抑菌防腐活性的天然資源已發(fā)展成為食品行業(yè)研究的新領(lǐng)域?？喙鲜且环N食藥兩用的天然植物,是常用蔬菜之一,具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、提高機(jī)體免疫力能力、抑菌等多種生物活性。已有研究表明,苦瓜提取液對(duì)11種165株革蘭陽性球菌、革蘭陽性桿菌和革蘭陰性桿菌具有抑菌抑菌作用,并且對(duì)肉類食品具有抑菌防腐作用,說明苦瓜是一種良好的天然廣譜抑菌劑。但現(xiàn)有對(duì)苦瓜抑菌的研究多集中在乙醇提取物方面,由于苦瓜乙醇提取物在水中的溶解度較低,限制了它在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。鑒于此,本文研究了苦瓜水提物的抑菌作用,并與常用食品防腐劑山梨酸鉀的抑菌效果進(jìn)行對(duì)比,以探討苦瓜水提物作為食品天然防腐劑的應(yīng)用前景。1材料和方法1.1受試菌種sq基層苦瓜粉:實(shí)驗(yàn)室自制,以市售新鮮苦瓜(為同一品種的油瓜類苦瓜)作為原料,洗凈,用切片機(jī)將其切成均勻的薄片,50℃烘干,粉碎,過40目篩,干燥保存。山梨酸鉀:市售食品添加劑。細(xì)菌菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),大腸桿菌(Escherichiacoli),沙門氏菌(Salmonellasp.);霉菌:黑曲霉(Aspergillusniger),米曲霉(Aaperiyillusoryzae);酵母:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),黏紅酵母(Rhodotorulaglutinnis)。上述受試菌種購于廣東省微生物研究所。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌用)、馬鈴薯培養(yǎng)基(霉菌、酵母用):按照文獻(xiàn)配制。1.2實(shí)驗(yàn)儀器與儀器EB-330H分析天平:SHIMADZU;HH-S數(shù)顯水浴鍋:上海錦屏儀器儀表有限公司;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:日本;LDZX-405AI立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;LRH-150-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱:廣東省醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái):上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV-1700紫外-可見掃描儀:SHIMADZU。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1苦瓜水提物的制備稱取苦瓜干粉,以1∶30的質(zhì)量比例加入蒸餾水,60℃水浴回流提取2次,每次4h,合并濾液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮,真空冷凍干燥,得到苦瓜水提物,于冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。稱取適量苦瓜水提物以無菌蒸餾水分別配制成20、40、60、80mg/mL濃度的水溶液備用。1.3.2菌種培養(yǎng)和培養(yǎng)將所有供測(cè)試的菌種移接入相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng),每種接多支重復(fù)。細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;酵母、霉菌置30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。將上述活化好的各種菌分別挑取一環(huán)制成初試菌懸液,取適量初試菌懸液用生理鹽水將其稀釋成含菌量為1.0×108cfu/mL的菌懸液備用。1.3.2抑菌圈測(cè)定用無菌吸管吸取上述各種菌懸液0.1mL于無菌平皿中,然后倒入15mL已冷卻至45℃經(jīng)高壓滅菌后相應(yīng)的培養(yǎng)基,充分混勻后水平放置,制成含菌平板。用無菌鑷子將滅菌后直徑5mm的小圓濾紙片置入苦瓜水提物樣品液中,浸泡0.5h后取出,貼于平板上,每個(gè)紙片相隔一定間距,每種菌各設(shè)3個(gè)重復(fù),以常用食品防腐劑濃度20mg/mL的山梨酸鉀水溶液和無菌水作為對(duì)比和對(duì)照,放入培養(yǎng)箱中,37℃下細(xì)菌培養(yǎng)24h,霉菌30℃下培養(yǎng)48h。按時(shí)取出,測(cè)定抑菌圈直徑,取其平均值為測(cè)定結(jié)果。以上操作均在超凈工作臺(tái)上完成。判定標(biāo)準(zhǔn):以抑菌圈直徑大于5mm者評(píng)價(jià)為有抑菌作用,無菌水對(duì)照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生,否則實(shí)驗(yàn)無效。無菌水對(duì)照組所測(cè)直徑為濾紙片直徑。1.3.3菌種生長(zhǎng)測(cè)定121℃濕熱滅菌30min。用試管二倍遞減稀釋法將苦瓜提取物配制成600、300、150、75、37.5、18.75、9.375mg/mL濃度的苦瓜水提物系列培養(yǎng)基,每一系列接種一種菌,每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。以常用防腐劑山梨酸鉀作對(duì)比,并以無菌水作對(duì)照,置于培養(yǎng)箱中,細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h,霉菌、酵母30℃下培養(yǎng)48h。觀察生長(zhǎng)現(xiàn)象。另取一稀釋系列,不接任何菌作為空白對(duì)照。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)物與空白對(duì)照在紫外-可見掃描儀上進(jìn)行比色測(cè)定,以二者光吸收值基本相同,即培養(yǎng)基中沒有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為苦瓜水提物的最低抑菌濃度。2結(jié)果與分析2.1苦瓜水提物的抑菌效果通過測(cè)定不同濃度苦瓜水提物樣品抑菌圈的直徑來評(píng)價(jià)其對(duì)受試食品常見污染微生物的抑制狀況。結(jié)果如表1所示。從表1可以看出,苦瓜提取物對(duì)受試細(xì)菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較好的抑制效果,當(dāng)苦瓜水提物濃度為20mg/mL時(shí)就有明顯的抑菌現(xiàn)象,均強(qiáng)于同等條件下相同濃度的食品防腐劑山梨酸鉀溶液;而且水提物濃度與抑菌圈之間具有量效關(guān)系,抑菌圈直徑隨水提物濃度增加而擴(kuò)大。表1的結(jié)果也表明,苦瓜水提物對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的抑制作用尤為顯著:濃度為40mg/mL時(shí)抑菌圈直徑均超過10mm、濃度為80mg/mL時(shí)抑菌圈直徑均在14mm以上,提示苦瓜水提物在用于預(yù)防細(xì)菌性食物中毒方面具有開發(fā)前景。此外,表1的結(jié)果表明苦瓜水提物對(duì)黑曲霉、米曲霉等受試霉菌和啤酒酵母、黏紅酵母等受試酵母的抑制效果不明顯,僅在濃度達(dá)到60mg/mL或者80mg/mL時(shí)才出現(xiàn)很小的抑菌圈,直徑均不超過5.5mm;而食品防腐劑山梨酸鉀則對(duì)上述微生物具有良好的抑制作用,濃度為20mg/mL時(shí)即產(chǎn)生相當(dāng)明顯的抑制效果,抑菌圈直徑均達(dá)到10mm以上。2.2最低抑菌濃度采用比濁法測(cè)定苦瓜水提物對(duì)各供試微生物的最低抑菌濃度。培養(yǎng)后的培養(yǎng)物與空白對(duì)照在紫外-可見掃描儀上進(jìn)行比色測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可見,當(dāng)苦瓜提取物及山梨酸鉀增加到一定濃度時(shí),培養(yǎng)物與空白對(duì)照吸光度基本相同,即此濃度下培養(yǎng)物中無菌生長(zhǎng),可確定該濃度為苦瓜提取物及山梨酸鉀的最低抑菌濃度,最低抑菌濃度分析結(jié)果見表3。表3的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了苦瓜水提物對(duì)受試菌中細(xì)菌的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于霉菌和酵母:對(duì)大腸桿菌的MIC為37.5mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的MIC達(dá)到18.75mg/mL;對(duì)黑曲霉和米曲霉的MIC為300mg/mL,對(duì)啤酒酵母和黏紅酵母的MIC為600mg/mL。山梨酸鉀則對(duì)受試酵母和霉菌的抑制效果顯著強(qiáng)于苦瓜水提物,對(duì)受試細(xì)菌的抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于苦瓜水提物。這一研究結(jié)果與前述濾紙片法的測(cè)定結(jié)果相吻合。3苦瓜水提物的抑菌活性成分已有研究表明,苦瓜對(duì)革蘭陽性球菌、革蘭陽性桿菌和革蘭陰性桿菌具有較好的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)證明了苦瓜水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等受試細(xì)菌具有良好的抑制作用,尤其對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌具有顯著抑制效果,說明苦瓜水提物在預(yù)防細(xì)菌性食物中毒方面具有應(yīng)用前景。已有研究表明,許多植物提取物對(duì)霉菌和酵母的抑制作用較弱或沒有抑制作用,本實(shí)驗(yàn)也表明了類似的研究結(jié)果,即苦瓜水提物對(duì)受試米曲霉和黑曲霉以及啤酒酵母和黏紅酵母顯示了較弱的抑制作用,可能因?yàn)榇痔嵛镏泻欣诿咕徒湍干L(zhǎng)的化學(xué)成分,削弱了抑菌活性成分對(duì)霉菌和酵母的抑制作用,如果將抑菌活性成分分離純化,則有可能增強(qiáng)其對(duì)霉菌和酵母的抑制效果。關(guān)于苦瓜水提物抑菌活性成分的確定及其分離純化尚有待進(jìn)一步探討。以往的研究表明,山梨酸鉀對(duì)霉菌和酵母的抑制作用強(qiáng)于其對(duì)細(xì)菌的抑制作用,本研究的結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等受試細(xì)菌的抑制作用遠(yuǎn)低于苦瓜水提物,而對(duì)受試米曲霉和黑曲霉以及啤酒酵母和黏紅酵母的抑制效果良好,遠(yuǎn)強(qiáng)于苦瓜水提物。因此,在開發(fā)新型食品防腐劑時(shí),可以考慮將苦瓜水提物和山梨酸鉀進(jìn)行復(fù)配,達(dá)到既提