植物shaserk+鉀離子通道基因研究進(jìn)展

k-是植物細(xì)胞中最豐富、植物生長發(fā)育所必需的陽離子。K+在酶活性的調(diào)節(jié)和膜電位的調(diào)整等一系列生理生化過程中起關(guān)鍵作用,也在維持植物細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡、細(xì)胞膨壓調(diào)整、調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)等生理過程中起重要作用。由于缺乏動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在的Na+/K+交換器,植物體K+吸收涉及K+通道和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體兩類系統(tǒng)。依據(jù)不同的結(jié)構(gòu)和功能可將K+通道分為ShakerK+通道、KCO通道和其他通道[如環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)]3大類。Anderson等和Sentenac等分別利用酵母的吸鉀缺陷性突變體,通過互補(bǔ)原理從擬南芥cDNA文庫中分離得到第一批植物K+通道基因KAT1和AKT1,它們的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能與最初在果蠅中鑒定的ShakerK+通道相似,因此被稱為ShakerK+通道基因。后來,又陸續(xù)在其他植物中發(fā)現(xiàn)了多種類型的ShakerK+通道基因,他們?cè)谶z傳及功能上與植物的K+營養(yǎng)運(yùn)輸及植物的生長密切相關(guān),被認(rèn)為是影響植物鉀營養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞鉀離子動(dòng)態(tài)平衡最為重要的功能蛋白。ShakerK+通道是迄今為止研究最深入的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)家族。本文主要介紹植物ShakerK+通道的結(jié)構(gòu)、表達(dá)部位、生理功能以及調(diào)控蛋白和陽離子對(duì)它們的調(diào)節(jié)作用。1植物sh東南角Shaker家族通道是K+通道中發(fā)現(xiàn)最早的。Shaker一詞來源于:在乙醚麻醉下缺失該基因的果蠅,自發(fā)強(qiáng)烈地抖動(dòng)其肢體,這種表現(xiàn)型的果蠅取名為Shaker(顫抖)突變子。植物ShakerK+通道與動(dòng)物ShakerK+通道家族在序列和結(jié)構(gòu)上具有高度同源性。植物ShakerK+通道多肽擁有一個(gè)典型的很短的N端結(jié)構(gòu)域,功能通道包括4個(gè)亞單位,每個(gè)亞單位擁有6個(gè)跨膜片段結(jié)構(gòu)(S1~S6),且均有內(nèi)部電壓感受器(voltagesensor),電壓感受器主要由蛋白質(zhì)的S2段、S3段和S4段的氨基酸殘基組成。S5和S6之間的高度保守的膜loop,稱為P(pore)結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是陷入細(xì)胞膜內(nèi)的一段多肽片段,構(gòu)成通道孔。其TXXTXGYG序列是植物和動(dòng)物細(xì)胞選擇性K+通道的一個(gè)標(biāo)記。植物Shaker鉀通道蛋白的C末端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),是調(diào)控通道活性的重要部位。C末端胞內(nèi)區(qū)有一個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)(cNBD),該區(qū)與K+亞單位相互作用有關(guān),并且在C端的最遠(yuǎn)端,形成了所謂的富含疏水性、酸性氨基酸的KHA結(jié)構(gòu)域。一些植物ShakerK+通道cNBD下游還有錨蛋白區(qū)(ANKY),它有助于通道與細(xì)胞骨架的連接、蛋白質(zhì)的相互作用和細(xì)胞溶質(zhì)的調(diào)節(jié)。植物Shaker鉀通道的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖1所示。Shaker通道的重要特點(diǎn)之一是能形成異源四聚體結(jié)構(gòu),可以使植物調(diào)節(jié)不同細(xì)胞中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性,這種調(diào)節(jié)在每個(gè)器官或組織中是獨(dú)立的,并與環(huán)境條件相關(guān)。自從采用酵母雙突變體互補(bǔ)法從擬南芥cDNA文庫中克隆到第一批K+通道基因KAT1和AKT1后,已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離得到多種ShakerK+通道基因。其中,擬南芥的ShakerK+家族基因是到目前為止研究得最透徹的植物K+吸收基因,該家族的K+通道蛋白有9個(gè)成員(表1)。目前已從煙草(NKC1)、水稻(QsAKT1)、玉米(ZMK1)、胡蘿卜(KDC1)等其他植物中陸續(xù)克隆出Shaker通道基因。Shaker通道是選擇性的K+通道,在很大程度上受電壓的調(diào)控,按照受電壓范圍及離子流方向的不同,植物ShakerK+通道可被劃分成內(nèi)向整流K+通道、外向整流K+通道和弱內(nèi)向整流K+通道3類。1.1植物根系k+通道基因內(nèi)向整流K+通道對(duì)K+濃度敏感,依賴電壓,對(duì)K+親和力低。內(nèi)向整流K+通道主要是存在于細(xì)胞的質(zhì)膜上,它在細(xì)胞膜超極化的條件下被激活打開,使胞外K+流入胞內(nèi)。如AKT1,AtKC1,KAT1,QsAKT1,ZMK1,KZM1等,現(xiàn)介紹如下:AKT1是第一個(gè)克隆到的植物內(nèi)向整流K+通道基因,采用酵母雙突變體互補(bǔ)法從擬南芥cDNA文庫中篩選出來的。早期認(rèn)為AKT1屬于低親和性鉀通道,后認(rèn)為AKT1是雙親和內(nèi)流型鉀通道。異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,AKT1只能在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)而不能在卵母細(xì)胞中表達(dá)。Northernblot分析表明,AKT1組織特異性較強(qiáng),主要在植物根系中表達(dá),尤其是在成熟根表皮、皮層和內(nèi)皮層,在植物根系從土壤中吸收K+時(shí)起重要作用。用Gus報(bào)告基因發(fā)現(xiàn),AKT1除了在成熟根的表層細(xì)胞中存在,在葉原基細(xì)胞和水孔中也存在。植物根系K+通道與低親和力(0.2~15mmol/L)和高親和力(1~200μmol/L)范圍內(nèi)運(yùn)輸K+有關(guān)。在低K+濃度范圍內(nèi)當(dāng)細(xì)胞高度超極化時(shí),K+的吸收也能被轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)。AKT1能在外部K+濃度為10μmol/L時(shí)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞K+的吸收積累。AtKC1是Reintanz等從擬南芥中分離克隆的α亞基類K+通道基因,主要在根部表達(dá)。AtKC1作為Shaker家族,卻不具有K+通道作用,但可通過調(diào)節(jié)AKT1,來中斷K+流進(jìn)入根毛細(xì)胞。AKT1和AtKC1都是一個(gè)異聚通道功能蛋白的組成部分。在異源表達(dá)系統(tǒng)中,AtKC1不能獨(dú)立形成一個(gè)有功能的離子通道。然而,當(dāng)AtKC1不能正常發(fā)揮功能時(shí),根毛中AKT1介導(dǎo)的內(nèi)向電流的生物物理特征就會(huì)發(fā)生改變。KAT1是與AKT1同時(shí)從擬南芥cDNA文庫中篩選出來的植物內(nèi)向整流K+通道基因。采用異源表達(dá)體系證明,KAT1能夠在卵母細(xì)胞和Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá),并且能夠轉(zhuǎn)運(yùn)K+。KAT1表達(dá)具有組織特異性,主要表達(dá)部位是保衛(wèi)細(xì)胞,在根和莖維管組織中也有少量表達(dá),并與外向整流K+通道GORK調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)有關(guān),當(dāng)脫落酸處理氣孔保衛(wèi)細(xì)胞時(shí),KAT1被磷酸化。KAT1對(duì)K+有高度選擇性。吳平等通過米氏方程式計(jì)算其Km為35mmol/L,它不是一種高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。人們認(rèn)為KAT1以低親和力K+吸收方式進(jìn)入保衛(wèi)細(xì)胞,在氣孔開合中扮演重要角色,并向維管組織轉(zhuǎn)運(yùn)K+,而不是直接從土壤中吸收K+。QsAKT1通道基因來源于水稻特化的cDNA文庫。Northernblot分析表明,OsAKT1主要在根組織中表達(dá),葉片組織上表達(dá)量較少。其表達(dá)具有明顯的細(xì)胞特異性,如:在根部,它在表皮和內(nèi)皮層細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈,而在脈管系統(tǒng)和外皮層細(xì)胞中表達(dá)量較少。有研究表明,OsAKT1在鹽脅迫下水稻吸收K+的過程中起重要作用。ZMK1是從玉米胚芽鞘中分離的K+通道基因,主要在皮層中表達(dá)。在卵母細(xì)胞中,ZMK1通過外部酸化激活內(nèi)向整流K+通道,研究表明,藍(lán)光對(duì)ZMK1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影響。KZM1是Philippar等從玉米中分離出來的1種內(nèi)向整流K+離子通道,主要在玉米葉片的保衛(wèi)細(xì)胞和脈管系統(tǒng)等部位表達(dá)。KZM1通道能調(diào)節(jié)韌皮部K+裝載/卸載以及氣孔開放。KZM1通道的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)模式與擬南芥的KAT2相似,但與KAT2相比,KZM1通道缺少細(xì)胞膜外局部分布的組氨酸,不受外部環(huán)境酸化的影響。來源于擬南芥花粉的內(nèi)向整流型SPIK有助于花粉發(fā)育,在μmol/LK+濃度范圍內(nèi)通過負(fù)膜電位維持K+的吸收,影響花粉管的正常發(fā)育和增強(qiáng)花粉的競(jìng)爭(zhēng)力。1.2透性離子檢測(cè)外向整流K+通道存在于植物的各類細(xì)胞中,具有電勢(shì)依賴性,可釋放K+流,在細(xì)胞膜去極化的條件下被激活打開,此時(shí)的跨膜電勢(shì)比較高,使K+由胞內(nèi)排出到胞外。外向整流K+通道對(duì)K+有較高的選擇性,其通透性遠(yuǎn)大于Na+、Li+等一價(jià)陽離子,是細(xì)胞中K+釋放外流的重要途徑。如GORK,SKOR等。GORK是從擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中鑒別出的外向整流K+通道基因。GORK是保衛(wèi)細(xì)胞中惟一的外向K+通道,當(dāng)膜去極化時(shí)GORK被激活。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)GORK在根毛細(xì)胞中也表達(dá),作為K+感受器來發(fā)揮作用。SKOR主要在根中表達(dá),使K+從木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)窖?。?dāng)K+被吸收進(jìn)入根中,SKOR通過中柱使它被轉(zhuǎn)移到木質(zhì)部運(yùn)往地上部芽,這可能是惟一對(duì)木質(zhì)部汁液中鉀分泌起作用的ShakerK+通道。此外,SKOR還在木質(zhì)部和花粉中表達(dá)。有研究表明,SKOR與GORK能進(jìn)行物理互作形成有功能的異聚外向整流通道。1.3sh-4通過k+調(diào)節(jié)nd1和akt2表達(dá)弱內(nèi)向整流K+通道根據(jù)K+電化學(xué)勢(shì)梯度使K+吸收或排出,如AKT2。AKT2是利用AKT1作為探針,從擬南芥cDNA文庫中克隆得到的。它與AKT1、KAT1有60%同源性。它能在卵母細(xì)胞中表達(dá)并具有轉(zhuǎn)運(yùn)K+的作用。AKT2是至今在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的惟一弱內(nèi)向整流K+通道,也是ShakerK+通道家族中惟一既能介導(dǎo)K+內(nèi)流又能調(diào)節(jié)K+外流的通道。AKT2在葉肉、葉表皮和保衛(wèi)細(xì)胞以及韌皮部表達(dá),參與通過韌皮部汁液長距離K+運(yùn)輸。AKT2對(duì)韌皮部K+的運(yùn)輸和膜電位的維持起作用,從而影響韌皮部K+裝載/卸載。此外,AKT2/3與擬南芥葉肉細(xì)胞的K+滲透性和保衛(wèi)細(xì)胞中鈣敏感性有關(guān)。2影響轉(zhuǎn)錄水平的因素在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平上調(diào)控ShakerK+通道活性,通道對(duì)刺激的敏感性不同。在不同環(huán)境(如光、溫度和鹽脅迫)和植物激素(如ABA和IAA)等因素下轉(zhuǎn)錄水平會(huì)發(fā)生變化。在翻譯后水平上,膜極化和胞內(nèi)因素(如H+、Ca2+和環(huán)核苷酸等)都能調(diào)控K+通道活性。下面主要介紹一些調(diào)控蛋白和陽離子對(duì)植物ShakerK+通道的翻譯后水平的調(diào)節(jié)作用。2.1磷酸酶atpp2ca和對(duì)akt2通道活性的調(diào)節(jié)植物鉀離子通道的活性受到多種蛋白的調(diào)節(jié),如磷酯酶、蛋白激酶、G蛋白和14-3-3蛋白等。細(xì)胞質(zhì)Ca2+的增加引起保衛(wèi)細(xì)胞中內(nèi)流K+通道的失活被特定蛋白質(zhì)磷酸酶2B的抑制劑阻遏。蛋白質(zhì)磷酸酶1和2A的抑制劑(okadaicacid和calyculinA),在nmol/L濃度下明顯抑制蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞中內(nèi)流K+通道,外流K+通道是否被影響尚未確定。葉肉細(xì)胞中內(nèi)流K+通道未受影響而外流K+通道則受這兩種抑制劑抑制。因此,蛋白質(zhì)磷酸酶1和2A對(duì)K+通道活性的調(diào)控可能受不同細(xì)胞類型的影響。蛋白質(zhì)磷酸酶2C家族(尤其是ABI1和ABI2)在脫落酸引起的氣孔關(guān)閉中起重要作用,但這種磷酸酶還沒有很明確的抑制劑。Chérel等利用酵母雙雜交及體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明,擬南芥磷酸酶AtPP2CA是AKT2的互作因子,且能夠調(diào)節(jié)AKT2的通道活性,進(jìn)而推斷AtPP2CA可能是通過蛋白的磷酸化與去磷酸化作用調(diào)節(jié)AKT2通道活性。Xu等通過研究擬南芥蛋白激酶AtCIPK23及Ca2+信號(hào)感受器AtCBL1/9與AtAKT1在體內(nèi)的相互作用,提出了植物響應(yīng)低K+脅迫的K+吸收分子調(diào)控的理論模型。根據(jù)該模型,外界低K+脅迫信號(hào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的變化,這種變化由位于細(xì)胞膜上的Ca2+信號(hào)感受器AtCBL1/9所感知,AtCBL1/9通過與AtCIPK23作用,將后者帶到細(xì)胞膜上。AtCIPK23通過磷酸化AtAKT1來激活該通道活性,AKT1內(nèi)向K+電流得到增強(qiáng),并最終提高植物在低K+條件下對(duì)K+的吸收能力。他們的研究為蛋白激酶通過磷酸化K+通道來調(diào)節(jié)通道活性提供了直接證據(jù)。研究磷酸化或去磷酸化對(duì)鉀離子通道調(diào)控的過程表明ATP和非水解ATP類似物可影響鉀離子通道的活性。在擬南芥葉肉細(xì)胞斑片中,ATP活化弱內(nèi)向整流型K+通道的電導(dǎo)率,這可能與AKT2有關(guān)。在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞中,雖然ATP對(duì)整個(gè)細(xì)胞的K+無影響,但是單通道表明內(nèi)流K+被這個(gè)核苷激活。應(yīng)用GTP和GDP類似物的原生質(zhì)體膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)G蛋白對(duì)K+通道具有調(diào)節(jié)作用,該類似物與G蛋白結(jié)合形成活性GTPγS或非活性GDPβS。在蠶豆中,GTPγS能減少保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)流K+量和植物葉肉細(xì)胞外流K+量。然而,GDPβS則增加保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)流K+量和植物葉肉細(xì)胞外流K+量。木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中G蛋白激活劑增加了內(nèi)流K+量。單獨(dú)的保衛(wèi)細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)G蛋白作用效果也具有膜限性。研究表明鈣能影響G蛋白對(duì)植物K+通道的調(diào)節(jié)作用。2.2植物外部ph值表1、2在通道孔中與Cs+的相互作用引起外部Cs+可逆阻塞是植物內(nèi)向整流K+通道的典型特征。KAT1中Cs+阻塞強(qiáng)烈依賴于膜電位,且阻塞效率隨膜電位的增加而提高。通過通道孔內(nèi)的氨基酸定點(diǎn)突變證實(shí)了因Cs+阻塞機(jī)制和Cs+在KAT1滲透途徑中的相互作用。大多數(shù)植物內(nèi)向整流K+通道被毫摩爾濃度Cs+阻斷,但LKT1和SKT1通道對(duì)Cs+超敏感,10~100μmol/LCs+足以抑制50%的起始流。反之,SPIK以電壓依賴的方式在Cs+含量高達(dá)50~100mmol/L時(shí)受阻。內(nèi)向整流型K+通道對(duì)Cs+的敏感性不同非常重要,因?yàn)镃s+在很大范圍內(nèi)是K+吸收的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另一方面,擬南芥根毛原生質(zhì)體的外向整流K+通道并不能被外部Cs+阻塞,原因可能是外向整流型K+通道正膜電位的產(chǎn)生使Cs+從通道孔排出,因而避免通道孔阻塞。細(xì)胞內(nèi)外pH也影響植物ShakerK+通道活性。KAT1和KST1被胞內(nèi)與胞外溶液酸化激活。KAT1內(nèi)部pH感受器已在S2和S3之間環(huán)118位被確定是組氨酸殘基。KST1組氨酸位于S3-S4連接區(qū),在通道孔內(nèi)作為外部pH感受器起作用,有助于通過轉(zhuǎn)移活化曲線到較少的負(fù)膜電位使KST1開放,而且對(duì)單通道電導(dǎo)率不產(chǎn)生任何影響。就KAT1來說,已經(jīng)表明KAT1外部pH傳感器的分子基礎(chǔ)與在KST1通道孔內(nèi)確定的不同。KAT1、KST1和SIRK屬于KAT1亞家族,通過胞內(nèi)和胞外化合物酸化作用增加電流。與KAT1和AKT1亞家族不同,質(zhì)子濃度增加抑制AKT2亞家族通道。AKT2/3、ZMK2和VFK1是被外部pH抑制,PTK2是由于胞質(zhì)酸化被抑制。外向整流型SKOR通道既能被內(nèi)部酸化又能被外部酸化阻塞,而GORK只被外部酸化阻塞。細(xì)胞外pH激活的通道流降低依賴于SKOR通道所激活電壓的增加,而單通道電導(dǎo)率實(shí)際上仍不變。外向整流型K+通道的pH值的依賴性與ABA誘導(dǎo)的細(xì)胞酸化和SKOR上調(diào)和抑制所致的保衛(wèi)細(xì)胞的胞外堿化有關(guān)。Ca2+和Ba2+等二價(jià)陽離子對(duì)植物ShakerK+通道的影響已有大量的研究。Ca2+幾乎是獨(dú)立地抑制ShakerK+通道,例如,Ca2+以電壓依賴的方式抑制玉米葉內(nèi)向整流型K+通道ZmK2.1、水稻根內(nèi)向整流型K+通道OsAKT1和白楊內(nèi)向整流型K+通道PTK2。Ba2+在不同程度上抑制KAT1和KAT2,KAT1對(duì)Ba2+敏感性比KAT2高。Ba2+是典型的K+通道(如煙草原生質(zhì)外向整流型K+通道)抑制劑,Ba2+能抑制保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)K+的內(nèi)流和外流以及抑制SKOR通道孔接近兩個(gè)陽離子(Ca2+和Ba2+)。3sh-ras檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及功能目前已從不同植物中克隆到多個(gè)ShakerK+通道基因,盡管人們對(duì)ShakerK+通道基因的結(jié)構(gòu)、生理功能和表達(dá)部位等方面有了一定程度的認(rèn)識(shí),但對(duì)于Shak