高效液相色譜法測定五味子種子中6個(gè)木脂素類成分

中藥的多成分決定了多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)的模型。指紋圖譜能較全面體現(xiàn)中藥成分的整體性,是目前符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制模式之一。一測多評法(QAMS)是指以樣品中某一典型組分為內(nèi)標(biāo),建立該組分與其他組分之間的相對校正因子(RCF),通過RCF計(jì)算其他組分的含量,適用于對照品難得或制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類多成分的同時(shí)測定。指紋圖譜和一測多評相結(jié)合可以相互取長補(bǔ)短,為更全面合理科學(xué)地評價(jià)中藥質(zhì)量提供技術(shù)支撐。五味子習(xí)稱“北五味子”,為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)?，F(xiàn)代研究表明,五味子具有保肝、抗氧化等藥理作用,木脂素類成分為其最主要的活性成分。本課題組先期研究發(fā)現(xiàn),五味子中的木脂素類成分85%以上存在于種子中(另文發(fā)表)。本研究采用指紋圖譜和一測多評相結(jié)合的方法,在建立五味子種子指紋圖譜的基礎(chǔ)上,建立了QAMS法同時(shí)測定五味子種子中6種木脂素類成分含量的方法。1藥物、試劑與材料WatersAlliance高效液相色譜系統(tǒng),包括e2695分離單元、2998二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站(美國Waters公司);ShimadzuLC-2010CHT高效液相色譜儀,包括LC-2010CHT溶液傳輸單元、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測器、LabSolutions色譜工作站(日本島津公司);SartoriusBT25S型電子天平(德國賽多利斯公司)。五味子醇甲(批號:110857-201211)、五味子酯甲(批號:111529-200604)、五味子甲素(批號:110764-201111)、五味子乙素(批號:1100765-200710)對照品購自中國食品藥品檢定研究院,五味子醇乙(批號:20120517)、五味子丙素(批號:20120517)對照品購自鼎瑞化工(上海)有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。五味子藥材(批號:130623)購自南通三越中藥飲片公司,加水(用水量剛好浸過藥材表面即可)浸泡5h,搓去果肉,種子45℃干燥24h后粉碎,過40目篩,得1號樣品;其余10批為醋五味子,購自江蘇省內(nèi)10家醫(yī)院中藥房,同法處理,得2~11號樣品。經(jīng)南通市藥品檢驗(yàn)所龔旭東主任中藥師鑒定,以上藥材的植物來源均為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.。2方法和結(jié)果2.1指紋譜的構(gòu)建2.1.1u3000定期密度條LichrosphereC18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱;流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0~10min,20%~60%A;10~30min,60%A;30~40min,60%~75%A;40~50min,75%~80%A);流速1.0mL/min;柱溫30℃;檢測波長217nm。2.1.2混合對照品溶液精密稱取五味子醇甲4.50mg、五味子乙素2.66mg,分別置10mL量瓶中,五味子醇乙2.04mg、五味子酯甲1.04mg、五味子甲素1.21mg、五味子丙素1.29mg,分別置5mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,配成6個(gè)對照品儲(chǔ)備液。精密吸取五味子醇甲、五味子乙素對照品儲(chǔ)備液各1mL,五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素對照品儲(chǔ)備液各0.5mL,置5mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,配成混合對照品溶液。將上述對照品儲(chǔ)備液、混合對照品溶液于4℃保存,備用。2.1.3提取方法提取率取樣品約1g,精密稱定,置50mL圓底燒瓶中,加5mL95%乙醇,浸泡30min,回流提取3次,每次1h,合并提取液,放冷,4000r/mim離心10min,上清液移置20mL量瓶中,加95%乙醇至刻度,搖勻,取1.7mL置10mL量瓶中,加95%乙醇至刻度,搖勻,即得。進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過。2.1.4儀器精密度試驗(yàn)精密吸取1號樣品供試品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄指紋圖譜,24個(gè)共有色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值的RSD分別小于0.22%和6.21%,表明儀器精密度良好。2.1.5指紋圖譜測定精密吸取1號樣品供試品溶液10μL,分別于制備后的0、3、6、9、12和24h進(jìn)樣測定,記錄指紋圖譜,24個(gè)共有色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值的RSD分別小于0.22%和6.34%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)取1號樣品各約1g,精密稱定,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,進(jìn)樣測定,記錄指紋圖譜,24個(gè)共有色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值的RSD分別小于0.18%和6.42%,表明樣品處理方法的重復(fù)性較好。2.1.7指紋圖譜共有模式的建立分別精密吸取11批樣品供試品溶液10μL進(jìn)樣測定,將11批樣品的指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A版),生成指紋圖譜共有模式,其中共有峰24個(gè)。精密吸取混合對照品溶液10μL進(jìn)樣測定,通過與對照品保留時(shí)間比對,指認(rèn)了五味子對照指紋圖譜24個(gè)共有峰中的6個(gè),分別為2號峰(五味子醇甲)、5號峰(五味子醇乙)、11號峰(五味子酯甲)、16號峰(五味子甲素)、21號峰(五味子乙素)、23號峰(五味子丙素)。選擇2號峰五味子醇甲為參照峰(S),以該參照峰計(jì)算相對保留時(shí)間和峰面積比值進(jìn)行方法學(xué)考察。見圖1、2。2.1.8指紋圖譜的相似度以共有模式作為對照指紋圖譜,采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A版)對11批樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià),結(jié)果表明相似度均大于0.980。見表1。2.2采用1-評價(jià)法測定了六種木脂素的含量2.2.1線性范圍的測定分別精密吸取混合對照品溶液1、3、6、9、12、15、18μL,進(jìn)樣測定,以峰面積Y對進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行回歸處理,得5種成分的回歸方程及線性范圍。見表2。2.2.2加樣回收率和rsd取1號樣品各約0.5g6份,精密稱定,分別精密加入一定量對照品,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,進(jìn)樣測定并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD。結(jié)果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的平均回收率分別為97.07%、96.99%、98.24%、97.33%、96.76%和96.50%,RSD分別為3.55%、3.19%、2.27%、3.61%、2.70%和2.84%。見表3。2.2.3rcf的計(jì)算RCF計(jì)算公式:fs/i=(Ws×Ai)/(Wi×As),其中,As為內(nèi)參物峰面積,Ws為內(nèi)參物質(zhì)量,Ai為某待測組分i峰面積,Wi為某待測組分i質(zhì)量。根據(jù)RCF計(jì)算公式可得(Ws×Ai)/As=fs/i×Wi,以Wi對(Ws×Ai)/As作回歸處理,所得回歸曲線的斜率即為RCF。以五味子醇甲為內(nèi)參物(A),取線性關(guān)系考察項(xiàng)下6個(gè)質(zhì)量點(diǎn)測得的數(shù)據(jù)計(jì)算得待組分五味子醇乙(B)、五味子酯甲(C)、五味子甲素(D)、五味子乙素(E)和五味子丙素(F)與內(nèi)參物的相對校正因子fA/B、fA/C、fA/D、fA/E和fA/F分別為0.8136、0.7934、0.9548、0.9483和0.6647。2.2.4色譜柱對校正因子的影響精密吸取混合對照品溶液10μL,進(jìn)樣分析,在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別考察了Waters、Shimadzu兩種高效液相色譜系統(tǒng)和SymmetryC18(250mm×4.6mm,5μm)、LichrosphereC18(250mm×4.6mm,5μm)兩種色譜柱對相對校正因子的影響,結(jié)果RSD均小于5%,表明在不同實(shí)驗(yàn)室、不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下具有良好的重現(xiàn)性。見表4。2.2.5色譜條件對重現(xiàn)性的影響本研究考察了相對保留值(ri/s=tRi/tRs)和保留時(shí)間差(Δti/s=tRitRs)兩種參數(shù)在兩種高效液相色譜儀和兩種不同型號色譜柱中的重現(xiàn)性,結(jié)果表明各待測成分相對保留值RSD均小于5%,可以用于待測成分色譜峰的定位,而保留時(shí)間差均大于10%,不宜采用。通過該法預(yù)測出峰時(shí)間后,若該色譜峰臨近還有其他色譜峰,再根據(jù)紫外吸收光譜、整體峰形或峰面積百分比,能夠在一定程度上準(zhǔn)確定位色譜峰。見表5。2.2.6藥代動(dòng)力學(xué)測定結(jié)果分別精密吸取1~11號樣品供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀測定。采用外標(biāo)法測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的含量,再用建立的QAMS法進(jìn)行含量計(jì)算,并以相對誤差為參數(shù)對兩種方法所得結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果表明,相對誤差均小于3%,提示建立的方法具有較好的可信度。見表6。3流動(dòng)相系統(tǒng)分離效果的測定3.1本課題組前期以回流次數(shù)、時(shí)間、乙醇濃度及用量4個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平,采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選了五味子種子種木脂素