啤酒生產(chǎn)中酵母菌中乳酸菌的分離與鑒定

在啤酒生產(chǎn)過程中，對啤酒的質(zhì)量至關(guān)重要。但實際生產(chǎn)中啤酒廠的酵母一般要連續(xù)使用多代,在循環(huán)使用過程中很容易染菌。乳酸菌是最容易污染、且危害較大的細菌。當(dāng)使用受到乳酸菌污染的酵母進行啤酒發(fā)酵時,會導(dǎo)致啤酒產(chǎn)生絲狀渾濁、酸味增加、雙乙酰超標(biāo)等質(zhì)量問題。因而對酵母定期進行微生物檢測、控制乳酸菌的污染是非常重要的。本文對種酵母中存在的乳酸菌進行了分離和初步鑒定。1材料和方法1.1材料表面1.1.1樣品連續(xù)使用5代以上的種酵母:取自濟南某啤酒廠。1.1.2乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸UBA固體培養(yǎng)基:酵母膏6.1g,蛋白胨15g,葡萄糖16g,K2HPO40.31g,KH2PO40.31g,MgSO4·7H2O0.12g,NaCl0.006g,FeSO4·7H2O0.006g,MnSO4·4H2O0.006g,番茄汁244mL,啤酒250mL,瓊脂20g。蒸餾水定容至1000mL,pH6.0。改良UBA固體培養(yǎng)基:UBA固體培養(yǎng)基中加入2%CaCO3。用來分離種酵母中的乳酸菌。PYG培養(yǎng)基:蛋白胨0.5g,胰酶解酪朊0.5g,酵母膏1.0g,葡萄糖1.0g,鹽溶液4.0mL,蒸餾水100mL,pH值自然。用來測定乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸的情況。鹽溶液成分:無水CaCl20.2g,MgSO4·7H2O0.48g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,NaHCO310g,NaCl2.0g,蒸餾水1000mL。麥汁培養(yǎng)基:將粉碎的粗麥芽與水按1:4在63℃水浴中保溫1h,升溫至65℃繼續(xù)保溫1h,至碘檢無色。糖化醪用紗布過濾,向濾液中加入30mL/L麥汁澄清劑,煮沸30min后過濾,麥汁糖度調(diào)至12°P。麥汁培養(yǎng)基用來測定低溫下乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸性能。1.2方法1.2.1l.4.4結(jié)論以無菌操作取25g酵母泥于裝有225mL無菌生理鹽水的500mL三角瓶中,振蕩均勻。用1mL無菌移液管吸取1.0mL稀釋液,注入到含9mL無菌生理鹽水的試管中,按相同的方法逐次稀釋到10-6。分別取10-4、10-5、10-63個稀釋度的菌懸液0.1mL涂布在改良UBA固體培養(yǎng)基傾倒的平板上,30℃恒溫培養(yǎng)5d,挑取產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落,反復(fù)劃線分離至獲得純菌株,4℃斜面保存。1.2.2空間分布及形態(tài)特征檢測乳酸的定性測定:無菌操作取菌株1環(huán),接入PYG培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48h。采用紙層析法定性測定PYG發(fā)酵液中是否含有乳酸,以確定產(chǎn)乳酸細菌。紙層析法:(1)展開劑:水:苯甲醇:正丁醇以1:5:5混合,然后加1%甲酸。(2)顯色劑:0.04%的溴酚藍乙醇溶液,用0.1mol/L的NaOH調(diào)pH6.7。將國產(chǎn)新華濾紙裁成25cm×25cm大小,在紙下方距邊約3cm處畫條橫線,每隔3cm畫一點作為點樣位置。毛細管點樣,用2%的標(biāo)準乳酸溶液作為對照。將濾紙放入層析缸,先用展開劑飽和已點樣的濾紙過夜,然后加展開劑開始層析。上行約20cm,取出晾干后噴顯色劑,觀察樣品上行是否出現(xiàn)有黃色斑點,測量各顯色斑點中心與點樣點之間的距離d1和點樣點到展開劑前沿的距離d2。計算Rf值:Rf=d1/d2培養(yǎng)特征和形態(tài)特征鑒定:將菌株接種在UBA固體培養(yǎng)基傾倒的平板上,30℃恒溫培養(yǎng)72h,觀察菌落特征。挑取單菌落,涂片,革蘭氏染色,顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。生理生化特征鑒定:將菌株依次進行碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸實驗、過氧化氫酶實驗、精氨酸產(chǎn)NH3實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、H2S的產(chǎn)生實驗等。1.2.3麥汁中酸菌的檢測500mL三角瓶中裝250mL麥汁培養(yǎng)基,接入乳酸菌的菌懸液,使麥汁中菌液濃度約為0.5×103個/mL。12℃培養(yǎng)72h。每6h取樣1次,測定酸度。以時間為橫坐標(biāo),酸度為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸曲線。1.2.4顯微紅色測定發(fā)酵液1mL置于100mL三角瓶中,用50mL冷卻后的蒸餾水稀釋,以酚酞為指示劑,用0.1mol/L的NaOH標(biāo)準溶液滴定至溶液顯微紅色,記錄用去的NaOH標(biāo)準溶液體積。酸度(°T)以100mL發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量計,即:2結(jié)果與討論2.1菌株的篩選將種酵母的稀釋液涂布在改良UBA固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5d后,挑取平板上溶鈣圈大的典型菌落。共得到5株菌種,依次命名為L1、L2、L3、L4、L5。2.2蘑菇的鑒定2.2.1l5菌pyg發(fā)酵實驗利用紙層析法對2%標(biāo)準乳酸溶液和L1、L2、L3、L4、L5菌的PYG發(fā)酵液進行對比實驗,結(jié)果見表1。根據(jù)Rf值測定的結(jié)果,在紙層析中L2和L3發(fā)酵液的Rf值與乳酸的Rf值基本一致,說明菌株L2、L3能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸。2.2.2發(fā)酵葡萄糖的最佳條件根據(jù)乳酸定性測定和革蘭氏染色的結(jié)果,只有L2、L3屬革蘭氏陽性菌,且能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸,符合乳酸菌的基本特征。對L2、L3進行其他生理生化特征鑒定。2.2.3微生物指標(biāo)lactabac城根據(jù)對菌株L2、L3形態(tài)學(xué)、生理生化等的鑒定,結(jié)果如表3、表4所示,認為L2、L3分別為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和有害片球菌(Pediococcusdamnosus)。2.3培養(yǎng)基的酸度對產(chǎn)酸的影響向麥汁培養(yǎng)基中接入L2、L3的菌懸液,培養(yǎng)72h的產(chǎn)酸結(jié)果見附圖,2株菌均使麥汁培養(yǎng)基的酸度上升約0.6°T,這足以使接種后的麥汁酸敗。3基丙氨酸pa從啤酒生產(chǎn)用的種酵母中分離到2株乳酸菌,經(jīng)鑒定認為分別是短乳桿菌(L.brevis)和有