基于基因表達(dá)的啤酒釀造品種遺傳連鎖圖譜研究

啤酒生產(chǎn)是生物技術(shù)中最古老的應(yīng)用形式之一。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，啤酒行業(yè)經(jīng)歷了重大變化，尤其是近年來的分段子生物技術(shù)在啤酒生產(chǎn)原料的鑒定和改進(jìn)、啤酒酵母菌的鑒定、育種和代謝控制以及啤酒發(fā)酵中污染各種細(xì)菌的鑒定、栽培和代謝的應(yīng)用，以及對啤酒質(zhì)量和啤酒口感的改善和縮短發(fā)酵周期。提高發(fā)酵效率，節(jié)約投資，促進(jìn)啤酒行業(yè)的發(fā)展。1啤酒制造原料的鑒定和改進(jìn)1.1天麻天麻大顆粒及相關(guān)基因的擴(kuò)增大麥?zhǔn)巧a(chǎn)啤酒的主要原料,其質(zhì)量品質(zhì)直接影響到麥芽制作,啤酒釀造過程和成品啤酒的質(zhì)量。而只有純品質(zhì)優(yōu)的啤酒大麥才能通過制麥工藝生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的麥芽,因此有效地鑒定和改良大麥品種是非常重要的。傳統(tǒng)的鑒定方法是通過麥粒的外觀形狀、生理生化指標(biāo)以及其在微型制麥中發(fā)芽品質(zhì)來鑒定,此法耗時長,重復(fù)性差,往往得不到滿意的結(jié)果。隨著分子生物技術(shù)的應(yīng)用,這一問題能得到較好解決。Gebre等學(xué)者研究認(rèn)為根據(jù)大麥中特定的醇溶蛋白結(jié)合模式將40種大麥品種分成17組,最為有效的分類體系是用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)將353種大麥品種根據(jù)其B型和C型醇溶蛋白的位置加以區(qū)分。Huston等研究者發(fā)現(xiàn)在凝膠上用特殊的酯酶染色可以看到同工酶的不同而反應(yīng)釀造大麥品種的清晰差別。Black等采用等電聚焦研究了三種可區(qū)分的蛋白質(zhì)組分,根據(jù)醇溶蛋白結(jié)合模式、球蛋白和過氧化物同工酶成功地區(qū)分了21種大麥。盡管這些手段在大麥品種鑒定上都是有效的,但尚不能夠鑒定一個混合樣品中所有可能的品種。北美大麥基因組圖譜計劃(NABGMP)采用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志的方法構(gòu)建了大麥的遺傳連鎖圖,分析確定了具有好幾百個分子標(biāo)記的相關(guān)聯(lián)圖譜。它的優(yōu)點在于能直接發(fā)現(xiàn)同源染色體上核苷酸堿基序列的差異,與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)標(biāo)志不同的是RFLP分析與基因表達(dá)無關(guān),且檢測容易、便于實現(xiàn)自動化。Blake等設(shè)計了115對順序標(biāo)記位點的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(STS-PCR)引物,可以通過這些引物直接PCR擴(kuò)增可以獲得大麥品種特異性的指紋圖譜(fingerprinting),該技術(shù)是啤酒大麥純度測定的一種適用技術(shù)。運(yùn)用該技術(shù)Chee等研究者選擇了14種制麥和釀造工業(yè)所用的重要大麥品種并將每一品種準(zhǔn)確地鑒定出來。Ko等研究者用來自于大麥α-淀粉酶基因引物,通過PCR成功地鑒定了形態(tài)上相似的制麥大麥。與此同時,Araki等采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RADP)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)DNA標(biāo)記技術(shù)成功地建立了11個品種的酒花基因指紋庫。對于未知品種的酒花只需提取其任一部分的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增便能在兩天內(nèi)鑒定出其品種來。1.2可減少麥芽發(fā)酵過程中-淀粉酶活性的基因分子標(biāo)記也被用來輔助大麥育種,在用分子標(biāo)記確定適合釀造蒸餾酒的大麥研究中,通過分子標(biāo)記對大麥第五染色體作圖,在育種程序中使用分子標(biāo)記選用最適合于蒸餾酒的大麥,其可能的機(jī)制是:與發(fā)酵能力相關(guān)的兩個基因繪圖到基因組區(qū)域,從而影響了β-淀粉酶活性,最終影響發(fā)酵能力。在補(bǔ)充麥芽酶譜提高大麥麥芽質(zhì)量的研究中,編碼耐熱真菌末端-1,4-β-葡聚糖酶(EGI)的基因被引入兩個大麥品種,基因在種子萌發(fā)期間表達(dá),糖化后產(chǎn)生具有活性的耐熱酶。由于由大麥產(chǎn)生的異源EGI缺少纖維素結(jié)合區(qū)域以及糖化底物是可溶性β-葡聚糖,它的實際應(yīng)用和糖化不會受到影響。實際證明,由這些種子產(chǎn)生的耐熱β-葡聚糖酶的數(shù)量有能力通過降低可溶性β-葡聚糖含量而降低麥汁的粘度。2葡萄糖母的分類、鑒定和改進(jìn)2.1菌株鑒定及pcr檢測傳統(tǒng)的酵母菌鑒定主要是根據(jù)其微觀形態(tài)特征及其生理生化特點建立起來的,由于酵母的表型特征較為復(fù)雜,使得鑒定工作困難。利用分子生物技術(shù)從遺傳本質(zhì)上對其進(jìn)行分類鑒定,使鑒定更為準(zhǔn)確、可靠。目前利用核酸雜交技術(shù)研究真菌DNA分子中堿基序列的同源程度,以此來表明同一屬內(nèi)各種間和屬內(nèi)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。Horgen和Vilgalys等研究結(jié)果表明在真菌中,用整個基因組進(jìn)行雜交,除近似種外,其余的序列同源性都較低。Vanghan等將這一項研究應(yīng)用于對酵母菌的鑒定中,發(fā)現(xiàn)啤酒酵母、貝酵母、薛瓦酵母、意大利酵母、葡萄汁酵母的DNA-DNA重結(jié)合表現(xiàn)出90%的堿基序列是相同的,所以他們認(rèn)為后4個種應(yīng)該歸并為啤酒酵母。利用電泳核型(EK)分析真菌的染色體數(shù)目及基因組測定、基因的雜交定位及基因作圖方面已得到了較滿意的應(yīng)用,利用該技術(shù)得到的核型圖譜已廣泛應(yīng)用于酵母的分類研究中。Carle等應(yīng)用這項技術(shù)在啤酒酵母中建立了電泳核型指紋圖譜。Schwartz等應(yīng)用脈沖電泳成功地分離了酵母的染色體DNA,并以建立了標(biāo)準(zhǔn)的酵母核型指紋圖譜。此外,其它幾種基于PCR和分子雜交技術(shù)的DNA標(biāo)記方法如限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP);微衛(wèi)星DNA指紋圖譜分析技術(shù);隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD);擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)在酵母分類鑒定研究方面也有較多的成功報道。分子標(biāo)記技術(shù)對酵母的鑒定有助于我們加深對形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)化的認(rèn)識,同時表型特征也可以用來驗證某一分子性狀對酵母的分類價值。2.2改進(jìn)的啤酒生產(chǎn)特性2.2.1減少-葡聚糖酶的活性盡管啤酒的原料大麥中含有一定量的β-葡聚糖酶,但在制麥和糖化中幾乎全部被破壞而失去活性。而通常使用的啤酒酵母不能利用β-葡聚糖。殘留的β-葡聚糖除了引起啤酒過濾困難外還影響啤酒的風(fēng)味和質(zhì)量。通常的解決方法是添加一定量的β-葡聚糖酶。William等將Bacillussubtilis的β-葡聚糖酶基因克隆于MFal啟動子和分泌信號序列下游,轉(zhuǎn)化啤酒酵母獲得的轉(zhuǎn)化子能產(chǎn)生具有活性的β-葡聚糖酶,其中85%可以從酵母細(xì)胞中分泌出來,但是由于麥汁的PH值相對較低,從而導(dǎo)致產(chǎn)生的β-葡聚糖酶在發(fā)酵中水解β-葡聚糖的活力很低。隨后Penttila等克隆了Trichodermareesei中編碼內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶的基因EG1I。將EG1I插入到酵母載體的磷酸甘油激酶基因(PGK)啟動子和終止序列之間,采用整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化啤酒酵母。所得轉(zhuǎn)化子可以有效地降低麥汁中的β-葡聚糖含量,加快啤酒的過濾速度而沒有改變啤酒的感官風(fēng)味和酵母原有的發(fā)酵性能。2.2.2低糖發(fā)酵的啤酒啤酒酵母一般只能利用單糖,雙糖及三糖,而不能利用約占麥汁總糖25%的多糖和糊精。成品啤酒中含有這些糖類物質(zhì)不利于肥胖人群和糖尿病人飲用。通過基因工程技術(shù)的改造能使酵母具有產(chǎn)生淀粉葡萄糖苷酶(AMG)或α-淀粉酶的能力,降解了麥芽四糖、糊精和淀粉,減少了成品啤酒中的糖分,生產(chǎn)出低糖低熱能的啤酒。William等將小麥的α-淀粉酶基因?qū)肫【平湍钢袠?gòu)建工程菌,實驗室規(guī)模的發(fā)酵試驗證明,含α-淀粉酶基因的工程菌的發(fā)酵能力較親株有明顯的提高。在史文慧等對酵母菌產(chǎn)乙醇的研究中,通過乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法將adh2基因成功導(dǎo)入酵母菌株,經(jīng)抗性篩選,得到adh2基因突變的雜交雙倍菌株,再由突變的雜合雙倍體菌株,通過四分體剖分獲得了一株adh2基因被刪除的突變單倍體菌株,經(jīng)過發(fā)酵實驗,發(fā)現(xiàn)adh2基因被刪除的突變單倍體菌株不利用乙醇。這株adh2基因被刪除的突變單倍體菌,由于其突變發(fā)生在染色體水平上,因而遺傳穩(wěn)定,在發(fā)酵中無需添加其它物質(zhì)以保證其存在優(yōu)勢,而且在發(fā)酵后期不能利用乙醇作碳源,從而減少了乙醇的消耗因而在生產(chǎn)中有一定的意義。2.2.3啤酒雙乙酰發(fā)酵試驗雙乙酰是影響啤酒風(fēng)味的重要成分,其含量(包括其前體α-乙酰乳酸)的多少,是啤酒口味成熟度的重要指標(biāo),加速啤酒的成熟即縮短后發(fā)酵的主要措施就是要除去雙乙酰。雙乙酰是由啤酒酵母細(xì)胞體內(nèi)所進(jìn)行的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸生物合成的中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸分泌到細(xì)胞體外時,由非酶促的氧化脫羧反應(yīng)自發(fā)產(chǎn)生的。利用基因工程策略增強(qiáng)α—乙酰乳酸脫羧酶的活性,提高纈氨酸生物合成以后的酶活,使α-乙酰乳酸在未轉(zhuǎn)化為雙乙酰之前就被迅速轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)是較好的降低啤酒雙乙酰含量的思路。α-乙酰乳酸脫羧酶在啤酒酵母中不存在,而在細(xì)菌中普遍存在。Sone等克隆了E.aerogenes的α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)基因在啤酒酵母中表達(dá),結(jié)果證明轉(zhuǎn)化子的每毫克蛋白有2~3個α—乙酰乳酸脫羧酶活力單位,轉(zhuǎn)化子所生產(chǎn)的嫩啤酒中雙乙酰含量很低。Fujii等將E.aerogenes的ALDC基因克隆到酵母整合質(zhì)粒(YIP)上,通過轉(zhuǎn)化將其整合到酵母的染色體上,得到含有20個以上ALDC基因拷貝的轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化株的ALDC基因在非選擇條件下穩(wěn)定。發(fā)酵試驗表明轉(zhuǎn)化子在主酵后的雙乙酰含量比親株低50%以上,而酵母的生長速度和乙醇的生成能力都沒有受到影響。Yamana等比較了乙醇脫氫酶(ADH1)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)啟動子對ALDC基因在啤酒酵母中表達(dá)所起的作用,實驗表明在發(fā)酵條件下含有PGK啟動子的ALDC基因在酵母中表達(dá)水平最高,說明PGK啟動子是ALDC基因在啤酒中高效表達(dá)的最強(qiáng)啟動子。2.2.4異源多倍體啤酒酵母菌在檢測亞硫酸鹽和生物合成途徑方面的應(yīng)用亞硫酸鹽是啤酒酵母硫代謝的中間產(chǎn)物,能與啤酒中主要的老化物質(zhì)羰基化合物通過復(fù)雜的反應(yīng)生成對風(fēng)味穩(wěn)定性無影響的較穩(wěn)定的復(fù)合物,能夠延長啤酒風(fēng)味的保鮮期。對啤酒酵母中含硫氨基酸的硫吸收和生物合成途徑的研究表明缺失編碼高絲氨酸鄰乙酰轉(zhuǎn)移酶(MET2)基因的酵母菌不能產(chǎn)生鄰乙酰高絲氨酸,從而不能對亞硫酸鹽的形成起阻遏作用,這樣缺失MET2基因的突變株中就能大量形成亞硫酸鹽。Hansen等用異源多倍體啤酒酵母為出發(fā)菌株,以G418抗性作為篩選重組子的標(biāo)記,構(gòu)建了缺失3或4個MET2拷貝或者是缺失3或4個MET10拷貝的異源多倍體酵母工程菌。發(fā)酵實驗證明這些重組子其它各方面性能指標(biāo)均較好,但發(fā)酵速度過慢。目前丹麥嘉士伯實驗室也正在進(jìn)行這方面的研究。2.2.5用木聚糖酶基因作酰氯及酵母基因型菌株的構(gòu)建發(fā)酵生產(chǎn)啤酒后的酵母細(xì)胞是啤酒生產(chǎn)重要的副產(chǎn)物,每生產(chǎn)100t啤酒就可得到含水分75%~80%的剩余酵母泥1.5t。這些酵母一般直接收集經(jīng)干燥后得到酵母粉,作為動物飼料,利用價值不高。通過基因工程技術(shù)可以進(jìn)一步提高啤酒廢酵母的商業(yè)價值,即通過轉(zhuǎn)入異源基因,在發(fā)酵結(jié)束以后使酵母能夠生產(chǎn)有價值的異源蛋白質(zhì)和糖類化合物。在這方面現(xiàn)在進(jìn)行的研究是將木聚糖酶基因?qū)肫【?木聚糖是由β-D-1,4-木糖苷鍵連接起來并帶有多種取代基的多聚糖,是一種巨大的生物資源,而木聚糖酶則是降解該物質(zhì)的最主要酶之一。Donaldo等將厭氧菌的耐熱木聚糖酶基因通過酵母載體pFLAGU2導(dǎo)入到啤酒酵母中,從而使該酵母在生長過程中能夠分泌木聚糖酶。Hinchliffe等將高價值的人血清白蛋白的基因克隆到啤酒酵母中,使其能夠調(diào)控表達(dá)。當(dāng)啤酒酵母進(jìn)行啤酒的生產(chǎn)發(fā)酵時,酵母所攜帶的人血清白蛋白的基因不表達(dá),而當(dāng)啤酒生產(chǎn)結(jié)束后,將酵母轉(zhuǎn)入含有誘導(dǎo)劑-乳糖的培養(yǎng)基中,人血清白蛋白的基因開始表達(dá),產(chǎn)生大量的胞內(nèi)人血清白蛋白。更重要的是,轉(zhuǎn)化子與親株相比,發(fā)酵能力相似,所生產(chǎn)的啤酒風(fēng)味上也沒有改變。此外,為了適應(yīng)多樣的消費(fèi)群體和使啤酒釀造技術(shù)更為合理,便于控制,有關(guān)研究者進(jìn)行了不同特色的酵母工程菌的研究,如構(gòu)建產(chǎn)無醇啤酒的啤酒酵母菌株,抗污染的啤酒酵母菌株,耐高滲透壓的啤酒酵母菌株等。但是啤酒是直接供給人們消費(fèi)的食品,在使用基因工程技術(shù)改良菌種的時候應(yīng)盡量使用食品級微生物的基因或啤酒生產(chǎn)所用的原料的基因。3啤酒雜菌的檢測在啤酒釀造中通常采用兩種傳統(tǒng)的方法檢測雜菌:一是培養(yǎng)生長在啤酒中的微生物,這種方法雖然可以較為準(zhǔn)確地測量雜菌,但時間較長對生產(chǎn)指導(dǎo)具有延緩性。二是通過分類學(xué)鑒定檢測雜菌,這種方法雖然快速,但難以預(yù)測被檢測到菌造成啤酒酸敗的能力。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為檢測啤酒雜菌提供了新的快捷方法,此方法快速靈敏,不需要微生物培養(yǎng)和分類學(xué)鑒定。目前美國、日本及我國的研究者都在致力這方面的研究,主要采用了三種技術(shù):使用特異性引物的PCR技術(shù),一些乳酸菌,尤其是Lactobacillus屬能對酒花中異α酸產(chǎn)生抗體,在啤酒中生長時引起啤酒酸敗給釀造工業(yè)帶來嚴(yán)重的問題。據(jù)研究能在啤酒中生長的具有酒花抗性Lactobacillus一般都帶有與酒花抗性有關(guān)的類horA基因,根據(jù)horA基因地編碼序列設(shè)計PCR引物,通過PCR擴(kuò)增就能預(yù)測出存在啤酒當(dāng)中的任一種Lactobacillus。使用嵌套多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以減少酵母細(xì)胞存在產(chǎn)生的干擾。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)在啤酒雜菌檢測中也較為常用,研究者使用寡聚核苷酸引物對微生物的16rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和比較,能夠鑒別出啤酒腐敗菌的屬種。?；蚪M簡單重復(fù)序列PCR是近幾年發(fā)展起來的DNA標(biāo)記技術(shù)可以用于檢測啤酒發(fā)酵中的雜菌污染即首先要設(shè)計特異性的引物,然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增細(xì)菌DNA重復(fù)元件如ERIC,BOX或者(GTG)5等,該技術(shù)與RAPD技術(shù)具有相似之處,但