氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)

氨基乙酸鈉（ce，也稱為urethan）已經(jīng)被證明是一種含有致癌物質(zhì)的藥物。世界衛(wèi)生組織也提議規(guī)定酒類飲料中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國和加拿大都已經(jīng)制訂了酒精飲料中氨基甲酸乙酯的限量標(biāo)準(zhǔn)。在氨基甲酸乙酯的形成過程中,瓜氨酸是其重要的前體物質(zhì)。在乳酸菌和酵母菌中的代謝過程中都有瓜氨酸的產(chǎn)生,而瓜氨酸的產(chǎn)生與其ADI酶系的代謝有關(guān)。本文通過對黃酒發(fā)酵過程中三種氨基酸的檢測,研究了黃酒發(fā)酵過程中三種氨基酸的變化規(guī)律,為進(jìn)一步的控制黃酒發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯的含量做準(zhǔn)備。1主要儀器和測定方法菌株:植物乳桿菌。麥曲和酒藥取自下沙黃酒廠,發(fā)酵參數(shù)參考自下沙黃酒廠。主要試劑:精氨酸,瓜氨酸,鳥氨酸,乙酸,α-萘酚,2,3-丁二酮,NaOH,磷酸,二乙酰一肟,茚三酮,均為國產(chǎn)分析純。水為桶裝純凈水。主要儀器:Boxun潔凈工作臺,上海;精宏恒溫培養(yǎng)箱,上海;精宏恒溫水浴鍋,上海;志威恒溫磁力攪拌器,上海;721可見分光光度計,上海;SL-N電子天平,上海;不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋,上海。測定方法:精氨酸的測定方法:參照賀小賢等(2007)的方法;瓜氨酸的測定方法:參照李加友等(2005)的方法;鳥氨酸的測定方法:參照黃愛清等(2005)的方法。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.1標(biāo)準(zhǔn)的精氨酸曲線在精氨酸含量為0~200μg/L范圍內(nèi),得回歸方程為Y=0.024+0.005X,線性相關(guān)系數(shù)R=0.995。2.2標(biāo)準(zhǔn)瓜氨酸曲線的繪制在瓜氨酸含量為0-200ug/L范圍內(nèi),得回歸方程為Y=-0.05+0.0075X,線性相關(guān)系數(shù)R=0.997。2.3標(biāo)準(zhǔn)鳥氨酸曲線的繪制在鳥氨酸含量為0-150ug/L范圍內(nèi),得回歸方程為Y=8×10-5+0.00959X,線性相關(guān)系數(shù)R=0.999。3在乳液發(fā)酵過程中，三種氨基酸的變化3.1植物精氨酸含量的測定在消毒的玻璃缸中,先加入200g經(jīng)過紫外滅菌的大米,然后加入300g涼開水,按照比例加入5ml培養(yǎng)好的植物乳桿菌培養(yǎng)液(用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)),每隔12h測試一次精氨酸,瓜氨酸,鳥氨酸的含量,測試96h。由于浸米階段大多在四天以內(nèi),過長的浸米時間不但會對黃酒的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面的影響,還會造成設(shè)備利用率過低,浸米水中營養(yǎng)損失嚴(yán)重等情況,因此,本實驗僅測試浸米4天內(nèi)的數(shù)據(jù)。3.2精氨酸的濃度變化3.3瓜氨酸的濃度變化3.4氨基丙烯酸的濃度變化4發(fā)酵過程中氨基酸濃度的變化4.1麥曲5g的發(fā)酵將200g大米浸泡18h,添加適當(dāng)水,蒸煮半個小時后,加入10g酒藥,置于30℃恒溫箱,每隔12h測試一次數(shù)據(jù),3天后加入麥曲20g,繼續(xù)發(fā)酵至7d后發(fā)酵結(jié)束。4.2精氨酸的濃度變化4.2瓜氨酸的濃度變化4.3氨基丙烯酸的濃度變化5討論5.1大量分解精氨酸和瓜氨酸,總引物的變化由圖4可知,精氨酸的含量在24小時候開始迅速升高,在60h的時候達(dá)到最高值,隨后開始下降。其變化曲線和菌落的生長曲線類似。由于在精氨酸的分解過程中,可以獲得能量,因此在后期階段,菌落開始大量分解精氨酸。從圖5可以看出而瓜氨酸的含量則在48h候開始升高,但是相對增長較少,在ADI酶系體系中,瓜氨酸也是中間體,其含量與精氨酸的生成和鳥氨酸的含量有關(guān)系。從圖6數(shù)據(jù),鳥氨酸的含量變化先升高,隨后在10~50h階段,比較平穩(wěn),在50h后一直是穩(wěn)步升高,同鳥氨酸開始增長的時間相符。由于鳥氨酸的含量的上升,可以使得瓜氨酸到鳥氨酸反應(yīng)減緩,促進(jìn)瓜氨酸的積累。在黃酒的工業(yè)化生產(chǎn)中,有時候會采用回加酸漿水的工藝,從本實驗數(shù)據(jù)可知,在40h內(nèi),基本沒有瓜氨酸的生成,因此,黃酒生產(chǎn)中浸米時間最好控制在兩天以內(nèi),不但可以避免營養(yǎng)物質(zhì)的損失,也可以控制瓜氨酸的生成。5.2麥曲發(fā)酵過程中瓜氨酸的變化本實驗參考下沙黃酒廠的工藝,先加入酒藥,然后在84h加入麥曲,先酒化后糖化。由圖7,精氨酸濃度的變化,在酒化發(fā)酵階段(0~84h),是先升高后降低的,在70h的時候,濃度達(dá)到最高,隨后降低。在加入麥曲后,精氨酸在120h時間點濃度迅速增高至140μg/L,隨后維持在比較高的水平,145h候開始下降,此時發(fā)酵已經(jīng)快要結(jié)束。根據(jù)圖8,瓜氨酸濃度變化在酒化階段和精氨酸類似,先升高后降低,在48h達(dá)到最高為7.5μg/L,隨后隨著酵母菌的衰亡期而降低,而在h后加入麥曲后,其濃度又開始迅速升高。但是在145h的時候,其濃度大為下降,隨后增長至9μg/L,在發(fā)酵的最后階段又下降,麥曲是復(fù)雜的多種微生物的互相作用的體系,對于其在糖化階段的變化還不能很好的解釋。但可以看出,在酒化和糖化階段,都有瓜氨酸的生成。在之前的研究中,主要集中于乳酸菌和酵母菌發(fā)酵過程中瓜氨酸的代謝,對于麥曲發(fā)酵中的瓜氨酸代謝尚待進(jìn)一步研究。而圖9數(shù)據(jù)顯示,鳥氨酸濃度在酒化階段和糖化階段都是穩(wěn)步升高的,并且可以看到,在36h后,和精氨酸一樣濃度開始迅速增加。而在84h后加入麥曲后,可以看到增長速度比酒化階段更快。6乳酸菌和酵母菌的精氨酸代謝體系本實驗通過模擬黃酒的發(fā)酵條件,研究了精氨酸,瓜氨酸,鳥氨酸在整個黃酒發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。精氨酸在乳酸發(fā)酵過程及后發(fā)酵過程中濃度隨著菌落生長過程先升高后降低,而鳥氨酸在兩個階段的發(fā)酵過程中則是濃度一直增高。乳酸菌和酵母菌的精氨酸代謝體系已經(jīng)研究較為清楚,而麥曲的精氨酸代謝體系尚待進(jìn)一步的研究。在過去的