川半夏資源親緣關系的sds-webg分析

蛋白質(zhì)分子受遺傳因素控制，通常存在于植物細胞中，反映了生物dna組成的差異。其中，可溶性蛋白質(zhì)在植物發(fā)育過程中具有強烈的異質(zhì)性和相對穩(wěn)定性。因此被廣泛應用于植物的遺傳標記、植物品種鑒定、品種間的遺傳變異以及遺傳多樣性分析。半夏為天南星科多年生草本植物,歷版《中國藥典》收載的半夏為Pinelliaternata(Thunb).Breit.,其以干燥塊莖入藥,性溫、味辛、有毒,是一種重要的中藥材。近年來,因部分地區(qū)藥用習慣,各地至少有同科3屬11種植物充作半夏使用,如水半夏、掌葉半夏、狗爪半夏等。半夏作為川產(chǎn)道地藥材,資源分布十分廣泛,但其形態(tài)變異(葉形變異、珠芽變異、塊莖變異)等問題一直未能有效解決。而目前對川半夏的研究,主要集中在成分分析方面。對川半夏可溶蛋白的研究僅有王雙明對綿陽本地半夏的15份材料作了親緣關系的初步探討。為此,本研究收集了16份川產(chǎn)半夏與9份其他產(chǎn)區(qū)的野生半夏,進行了可溶蛋白的遺傳多樣性分析,旨在探討川半夏資源的遺傳差異,為其分類鑒定以及資源保護利用等提供了一定參考依據(jù)。1briet材料供試材料見表1。經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學楊光輝教授鑒定供試材料包括23份半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit材料,2份掌葉半夏PinelliapedatisectaScotte材料。于2007-08引種在四川農(nóng)業(yè)大學教學科研實驗站,2008年春每份材料分別選擇直徑1cm左右的塊莖種植在相同地塊,每份材料種植2行,同一份材料各單株間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)基本一致。2方法2.1sds-溴化反應2008-12每份材料取大小基本一致的塊莖稱重,按1mg加2.5μl的冰水,研缽中勻漿,轉(zhuǎn)移至2ml離心管中冰浴浸提2h,使用前12000r/min,離心5min,取上清液50μl加入等體積樣品緩沖液(0.5gSDS,1ml2-Me,5ml甘油,0.5mg溴酚藍,500μlTris-HClpH6.8定容至25ml)混勻,100℃水浴5min,放冷至室溫,置4℃冰箱中備用。除樣品緩沖液中甘油含量減半外,葉片處理方法與塊莖相同。2.2氨基酸衍生物的誘導誘導酶活性檢測采用不連續(xù)分離系統(tǒng),分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為4%。電泳中所用的低分子量標準蛋白(14.3～97.2KD)購自寶生物工程(大連)有限公司,包括六種標準蛋白:磷酸酶b(97.2KD)、牛血清蛋白(66.4KD)、卵清蛋白(44.3KD)、碳酸苷酶(29.0KD)、胰蛋白酶抑制劑(20.1KD)、溶菌酶(14.3KD),在試驗中作為半夏可溶蛋白條帶對照。電泳儀為Bio-Rad公司的PROTEAN?ⅡXiell型電泳槽。電泳條件為指示劑在濃縮膠時,電流為20mA,當指示劑進入分離膠時,電流調(diào)為25mA,在常溫下進行,電泳時間為前沿指示劑溴酚藍剛好遷移至板底時立即停止電泳。電泳結(jié)束,每塊膠用300ml染色液(0.3g考馬斯亮藍R-250、135ml甲醇、30ml冰醋酸和135ml水定容至300ml)染色過夜,染色畢,將凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次,然后加入脫色液(37.5ml冰醋酸,25ml甲醇加水至500ml)反復脫色,至凝膠的藍色背景褪清、蛋白質(zhì)譜帶清晰為止。拍照,統(tǒng)計。隨機抽取5份材料,重復試驗以檢驗其電泳條帶是否一致。2.3ss聚類分析按條帶的有無對每份材料進行統(tǒng)計,條帶存在時賦值為1,否則賦值為0。按Nei的方法計算材料間的遺傳相似系數(shù)GS,遺傳距離GD=1-GS。GS=2Nij/(Ni+Nj),其中Ni為i號材料出現(xiàn)的條帶數(shù),Nj為j號材料出現(xiàn)的條帶數(shù),Nij為i號材料和j號材料共有的條帶數(shù)。利用GS值按不加權成對群算術平均法(UPGMA)進行遺傳相似性聚類分析。統(tǒng)計分析在NTSYSpc2.1系統(tǒng)下進行。3結(jié)果3.1電泳圖譜帶表面活性劑壓所有供試材料在同一條件下進行電泳,圖1為供試材料葉片可溶蛋白電泳圖譜,圖2為供試材料塊莖可溶蛋白電泳圖譜。各重復間的電泳圖譜,除個別極弱譜帶(未用于統(tǒng)計)外均表現(xiàn)一致。試驗結(jié)果表明,所有供試材料可溶蛋白電泳圖譜表現(xiàn)出一定的遺傳變異,表現(xiàn)在各材料間的電泳圖譜帶型上具有數(shù)量、位置和染色深淺不同的帶紋。而經(jīng)SDS分離的可溶性蛋白譜帶中葉片的帶數(shù)比塊莖的豐富。葉片共分離出19條遷移率不同的帶紋,3條帶紋為所有材料共有,每份材料可分離出8～18條比較清晰的帶,平均13.5條。塊莖共分離出了12條遷移率不同的帶紋,3條帶紋為所有材料共有,每份材料可分離出5～12條比較清晰的帶,平均9.6條。3.2川夏各材料間的遺傳相似系數(shù)gs所有半夏材料葉片可溶蛋白平均GS值為0.786,變異范圍為0.333～1.000,而2份掌葉半夏遺傳相似系數(shù)GS值0.933,半夏與掌葉半夏遺傳相似系數(shù)GS平均值0.687。川半夏與其他省半夏材料間遺傳相似系數(shù)GS平均值0.693。所有材料葉片可溶蛋白S07-14與S07-27遺傳相似程度最低,GS值僅為0.333,說明它們之間的遺傳差異最大。塊莖可溶蛋白中,所有半夏材料內(nèi)遺傳相似系數(shù)變幅為0.500～1.000,平均值0.738,而2份掌葉半夏遺傳相似系數(shù)GS值為0.857,半夏與掌葉半夏遺傳相似系數(shù)GS平均值0.678。川半夏與其他省半夏材料間遺傳相似系數(shù)GS平均值0.703。所有材料塊莖可溶蛋白遺傳差異最大的兩份材料是S07-20與S07-3,GS值為0.500。3.3可溶性蛋白及掌葉織物對25份供試材料間的可溶蛋白遺傳相似系數(shù)按UPGMA法進行聚類分析(圖3～4)。從聚類圖可以看出,無論是塊莖還是葉片,其可溶蛋白在GS值為0.817水平上所有材料都可以聚為五大類。葉片可溶蛋白第Ⅰ類包括來自四川、江蘇、貴州、河南、云南、安徽六省共17份材料,第Ⅱ類包括四川雅安的兩份材料及都江堰、宜賓共4份材料,河南內(nèi)鄉(xiāng)夏關的1份三葉半夏單獨為第Ⅲ類,四川閬中的1份栽培品種與四川江油的1份材料聚為第Ⅳ類,第Ⅴ類僅有1份來自山東榮城的材料。兩份掌葉半夏均聚在第Ⅰ類。塊莖可溶蛋白第Ⅰ類聚有17份材料,分別來自四川、江蘇、貴州、河南、山東、安徽六省,第Ⅱ類由河南的1份五葉狹葉半夏與四川廣元1份材料,四川南充的2份材料聚為一類,第Ⅲ類由都江堰和雅安周公山的2份材料組成,2份虎掌半夏聚為第Ⅳ類,云南的1份材料構(gòu)成第Ⅴ類。4討論4.1加快葉片的誘導酶系統(tǒng)和可溶性蛋白的電泳譜帶分析李麗、郭巧生等研究表明,半夏種內(nèi)不同居群同工酶存在明顯的遺傳差異。謝中穩(wěn)根據(jù)對7個半夏居群成熟葉片與塊莖的2個酶系統(tǒng)和可溶蛋白的電泳譜帶分析,認為半夏是一個遺傳多態(tài)性物種。本研究對25份半夏資源的葉片和塊莖進行了可溶性蛋白圖譜分析,分別分離19種和12種不同的帶紋中都僅有3條帶紋為所有材料共有,表明半夏資源的遺傳多樣性豐富。4.2半細胞染色體核型植物的繁殖方式?jīng)Q定了基因在代間的傳遞情況,影響到居群的遺傳結(jié)構(gòu)。半夏繁殖方式復雜:以珠芽或子塊莖進行營養(yǎng)繁殖為主,兼有有性繁殖和無融合生殖,正是這種以無性繁殖為主的繁殖方式,才使各地遺傳變異在獨立的環(huán)境中被保存下來,半夏繁殖方式的特殊性使得半夏細胞染色體數(shù)目復雜多變,存在復合多倍體以及非整倍性,本研究的25份材料就包括2n=26,54,78,84,88,91,101,104,117在內(nèi)的9種不同數(shù)目的染色體數(shù),其中16份川半夏就有8種不同數(shù)目的染色體數(shù)(另文發(fā)表),聚類分析結(jié)果表明,染色體數(shù)目相同或相近的材料有聚在一起的趨勢,但也有少數(shù)例外,且這種趨勢在葉片可溶蛋白中的反應比塊莖可溶蛋白中明顯。如葉片可溶蛋白中染色體數(shù)目為2n=88的三份材料SO7-10、SO7-31和SO7-01在GS=0.912水平上聚類在一起。4.3川夏各品種間的遺傳相似性程度的對比Barker等認為遺傳距離的信息應作為決策保種計劃時群體結(jié)構(gòu)和品種分化最基本的指標。遺傳距離是研究物種遺傳多樣性的基礎,一般認為群體分化時間越短,遺傳距離越小,遺傳相似性越大。對比16份川半夏、7份省外產(chǎn)區(qū)半夏與掌葉半夏的GS值后發(fā)現(xiàn),川半夏種內(nèi)的GS值高于川半夏與省外產(chǎn)區(qū)的GS值,說明川半夏之間遺傳相似程度相對比川半夏與其他省的半夏材料間的相似程度大,是相對比較獨特的地方宗。本試驗結(jié)果還表明,川半夏種內(nèi)的GS值高于川半夏與掌葉半夏間的GS值,即種間遺傳差異大于種內(nèi)遺傳差異。從葉片電泳圖譜也可以看出,幾乎所有半夏材料顏色最深、最寬的帶紋,在掌葉半夏中并未出現(xiàn)。進一步說明了二者確實存在真實的遺傳差異,部分地區(qū)采用虎掌半夏替代半夏用藥需慎重。通過對聚類結(jié)果進行分析,發(fā)現(xiàn)不同葉型的半夏材料并不能單獨聚類。如來自河南的五葉狹葉半夏,盡管形態(tài)比較特殊,但