高脂血癥小鼠模型的建立及降血脂保健食品功能檢測研究

在19世紀，人們的生活水平顯著提高。同時，與生活方式相關的疾病已成為威脅人類健康的主要原因。在我國心腦血管疾病的死亡率已經(jīng)上升到第二位。高血脂癥,即血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的增高是引起心腦血管疾病的一個主要原因。大量的流行病學調查和研究均表明,高脂血癥是動脈粥樣硬化(AS)、冠心病(CHD)、高血壓、糖尿病、膽石癥等多種疾病的重要危險因素,嚴重危害人類健康。因此,研究能夠調節(jié)血脂的保健食品對預防疾病,保護人民身體健康有重要的意義[1～5]。然而,在高血脂癥的機制研究、新型保健食品開發(fā)及新藥研究中,都需要快捷、準確、質量穩(wěn)定的高脂血癥動物模型。目前制備高脂血癥動物模型主要有表面活性劑法、免疫學法、同型半胱氨酸法、轉基因法及高脂飼料喂養(yǎng)法等等。其中高脂飼料喂養(yǎng)法由于其簡便易行是目前國內建立高血脂動物模型的常用方法。由于大鼠代謝較穩(wěn)定,且血量充足,造成高血脂動物模型的成功率高,因此在降血脂保健食品研究中通常采用大鼠制備高血脂模型。但是飼養(yǎng)大鼠占地面積大,所用高脂飼料消耗多。如果用小鼠代替大鼠,飼養(yǎng)經(jīng)費能夠節(jié)省約2/3,且動物房使用面積能夠節(jié)省約4/5。由于小鼠的代謝情況與大鼠有很大不同,能否用小鼠建立起穩(wěn)定的高血脂模型,進而代替大鼠進行降血脂保健食品功能評價研究是本課題要解決的問題。為此,我們采用高脂飼料喂養(yǎng)法,觀察小鼠進食高脂飼料60d內血脂變化情況,觀察比較兩種降血脂保健食品對高血脂小鼠和高血脂大鼠血脂各項指標的影響,從而對高血脂小鼠模型的穩(wěn)定性和在降血脂保健食品功能檢測研究中的實用性進行初步評價。1材料和方法1.1動物及微生物選用北京維通利華實驗動物技術有限公司繁殖的健康清潔級21～26g昆明種雄性小鼠72只,150～200gWistar雄性大鼠48只[許可證號:SCXK-(京)2002-0003]。1.2儀器和試劑1.2.1儀器755型分光光度計;恒溫水浴鍋;離心機;攪拌器。1.2.2中生北控生物技術總膽固醇試劑盒中生北控生物技術股份有限公司;甘油三酯試劑盒中生北控生物技術股份有限公司;高密度脂蛋白膽固醇試劑盒中生北控生物技術股份有限公司。1.3降血脂飲食功能紅曲醋1號義烏丹溪酒業(yè)有限公司;功能紅曲醋2號義烏丹溪酒業(yè)有限公司。2結果與分析2.1脂肪狗模型的制備和穩(wěn)定性的觀察2.1.1動物分組及處理小鼠給予正常基礎飼料7d后,眼眶取血,分離血清,測定血清中總膽固醇(TC),甘油三脂(TG)。根據(jù)TC水平隨機分為兩組:正常對照組和高脂模型組,每組12只。高脂模型組進食高脂飼料(78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽)。正常對照組進食正常基礎飼料。兩組動物均飲用自來水(經(jīng)紫外消毒)。在喂養(yǎng)過程中的30、45、60d,分別從正常對照組小鼠和高脂模型組小鼠眼眶取血,測定TC和TG。2.1.2高脂飼料對小鼠血清總膽固醇的影響由表1可見,實驗前高脂模型組小鼠血清總膽固醇與正常對照組比較,差異無顯著性(p>0.05)。正常對照組小鼠實驗第30、45和60d,與本組實驗前比較,血清總膽固醇無顯著性差異(p>0.05)。而飼喂高脂飼料的小鼠實驗第30d與本組實驗前比較,血清總膽固醇顯著升高(p<0.05);實驗第30、45和60d,飼喂高脂飼料的小鼠其血清總膽固醇水平顯著高于正常對照組。從表1中還可以看到,進食高脂飼料30～60d,高脂模型組小鼠血清總膽固醇始終維持在一個高的水平上?？梢?在喂食小鼠高脂飼料第30d,小鼠TC就有明顯升高,且在造成高膽固醇動物模型之后的30d內能繼續(xù)維持。2.1.3高脂模型小鼠血清酯類基因型的影響由表2可見,實驗前高脂模型組小鼠血清TG與正常對照組比較,差異無顯著性(p>0.05)。正常對照組小鼠飼喂正?；A飼料60d中,血清甘油三酯無顯著性變化,一直處于本組實驗前的水平(p>0.05)。而飼喂小鼠高脂飼料30d后,與實驗前比較,高脂模型組小鼠血清甘油三酯顯著升高(p<0.01);而在造成高甘油三酯動物模型后的30d當中,高脂模型組小鼠血清甘油三酯仍能繼續(xù)維持在這個高水平上。綜合表1和表2的結果可知,給小鼠飼喂高脂飼料30d可以造成高血脂模型,在繼續(xù)飼喂高脂飼料30d里,觀察到此高血脂模型能夠繼續(xù)維持。2.2脂肪狗模型的實用性和可行性的評價2.2.1功能紅曲醋小鼠血脂指標變化給予小鼠正?；A飼料7d后,禁食12h,眼眶取血,分離血清,測定血清中TC、TG和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。根據(jù)TC水平將小鼠分為四組:正常對照組﹑高脂對照組﹑功能紅曲醋1號組﹑功能紅曲醋2號組,每組12只。功能紅曲醋1號組﹑功能紅曲醋2號組飼喂高脂飼料(78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽),同時每日一次灌胃按1:4(醋:水)稀釋的功能紅曲醋,小鼠灌胃體積為0.2ml/10gbw。高脂對照組飼喂高脂飼料,正常對照組飼喂正常基礎飼料,高脂對照組和正常對照組每日一次灌胃與功能紅曲醋組同體積的自來水(經(jīng)紫外消毒)。連續(xù)給予受試物53d后禁食12h,測定各組動物血脂三項指標,用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計。由表3可見,實驗前功能紅曲醋1、2號組小鼠TC與高脂對照組比較,差異均無顯著性(p>0.05)。實驗53d后,高脂對照組與本組實驗前比較TC含量顯著升高,表明小鼠高TC模型制備成功。此時灌胃功能紅曲醋53d的2號組小鼠血清TC含量顯著低于高脂對照組(p<0.05),表明功能紅曲醋2號具有降低血清總膽固醇含量的作用。從表3中還可以看到,實驗前功能紅曲醋1、2號組小鼠TG與高脂對照組比較,差異均無顯著性(p>0.05)。實驗53d后,高脂對照組與本組實驗前比較TG含量顯著升高,表明小鼠高TG模型制備成功。此時灌胃功能紅曲醋53d的1、2號組小鼠血清TG含量均顯著低于高脂對照組(p<0.05),表明功能紅曲醋1、2號均具有降低血清甘油三酯含量的作用。從表3中還可知,給予小鼠相同劑量的功能紅曲醋53d后,兩個實驗組血清HDL-C與高脂對照組比較均無顯著變化(p<>0.05)。表明功能紅曲醋1、2號對高血脂小鼠HDL-C含量無顯著影響。2.2.2小鼠血脂指標的測定動物分組及飼喂情況同2.2.1。功能紅曲醋1號組、功能紅曲醋2號組每日一次灌胃按1:4(醋:水)稀釋的功能紅曲醋,大鼠灌胃體積為1ml/100gbw,高脂模型組和正常對照組每日一次灌胃與功能紅曲醋組同體積的水。連續(xù)給予受試物53d后禁食12h,測定各組動物血脂三項指標。由表4可見,實驗前,功能紅曲醋1,2號組大鼠TC、TG、HDL-C與高脂對照組比較,差異均無顯著性(p>0.05)。實驗53d后,高脂對照組與本組實驗前比較TC、TG含量顯著升高,表明高脂模型制備成功。此時灌胃功能紅曲醋53d的2號組大鼠血清TC含量顯著低于高脂對照組(p<0.05),表明功能紅曲醋2號具有降低血清總膽固醇含量的作用。灌胃功能紅曲醋53d的1、2號組大鼠血清TG含量均顯著低于高脂對照組(p<0.05),表明功能紅曲醋1、2號均具有降低血清甘油三酯的作用。兩個實驗組與高脂模型組比較,功能紅曲醋1、2號組大鼠血清HDL-C差異均無顯著性(p>0.05)。說明功能紅曲醋1、2號對高血脂大鼠HDL-C無顯著影響。2.2.2實驗結果得到的結論與用小鼠為實驗材料所進行實驗得出的結論相一致。3不同降血脂保健功能評價實驗擴大的結果分析據(jù)不完全統(tǒng)計,我國近年來心腦血管疾病占我國居民總死亡原因39.4%。而這些心血管疾病,絕大多數(shù)是由于高血脂導致的動脈硬化而引起的。因此,如何能找到一種有效的保健食品,在人們日常飲食的過程中就可以起到對血脂的控制、對心腦血管的保護已經(jīng)成為本世紀保健食品領域的重大研究熱點。然而,任何一種保健食品在上市前,都要經(jīng)過多次動物實驗,不斷探索出最合適的配方及生產工藝,這就需要首先建立高血脂動物模型。用大鼠為實驗材料做這些前期工作無疑要花費大量的經(jīng)費,如果能用小鼠代替大鼠做保健品的前期配方篩選工作既可減少經(jīng)費又能節(jié)省空間。對于降血脂保健食品功能評價實驗,如果用小鼠取代大鼠,存在三個要解決的問題。一是在降血脂保健食品功能評價研究的動物實驗中,測定規(guī)定的血脂三項指標,用常規(guī)的試劑盒方法,每只動物的最少采血量也需要500μl。用大鼠為實驗材料勉強可行,而以小鼠為實驗材料就會出現(xiàn)采血量過大導致動物失血過多的問題。這一問題在本實驗室已經(jīng)得到解決。第二個問題是小鼠高血脂模型建立成功后在整個實驗期間是否穩(wěn)定。盡管目前有一些用小鼠為實驗材料進行保健食品降血脂功能評價實驗的報道,在這些報道中也都建立了小鼠的高血脂模型,但很少有關于高血脂模型建立后是否能夠在整個實驗期間穩(wěn)定的研究報道。小鼠代謝情況與大鼠有很大差別,如果實驗中建立的小鼠高血脂模型在給予受試物階段不穩(wěn)定,就會給實驗結果帶來很大誤差。因此本文研究了在本實驗條件下所建立的小鼠高血脂動物模型的穩(wěn)定情況。從表1的結果可以看到,給小鼠飼喂高脂飼料30d后,與本組實驗前及與對照組比較,小鼠血清TC和TG含量顯著升高(p<0.05);而在造成高血脂動物模型后的30d當中,高脂模型組小鼠血清TC和TG含量一直能夠維持在這個高水平上。實驗結果說明用本實驗方法所建立起來的小鼠高血脂模型在進行保健食品降血脂功能評價實驗期間是穩(wěn)定的。第三個問題是用小鼠為實驗材料進行降血脂保健食品功能評價實驗,其結果是否與用大鼠進行同一實驗的結果相一致。表3、4的結果,是大鼠與小鼠在同一時間,在相同的實驗條件下,分別灌喂相同兩種受試物后所得到的結果。這兩個表的結果相比較,特別是兩個實驗所得出的結論相比較可以看到也是一致的。因此這個實驗證明了在降血脂保健食品功能評價實驗中用小鼠代替大鼠基本上是可行的。用大鼠進