基因探針法在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用吳豪要：DNA基因探針技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種高新生物技術(shù),并以其敏感性、特異性、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn),在食品科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。這篇文章著重介紹了這一種技術(shù)的基本原理及其在食品檢測(cè)中的應(yīng)用概況,并對(duì)其在食品檢測(cè)領(lǐng)域里應(yīng)用存在的問題進(jìn)行了分析和闡述。技術(shù)原理： 基因探針技術(shù)即DNA探針技術(shù)，又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性，對(duì)某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。 兩條不同來源的核酸鏈如果具有互補(bǔ)的堿基序列,就能夠特異性的結(jié)合而形成分子雜交鏈。若在已知的DNA或RNA片段上加上可識(shí)別的標(biāo)記(如用32P同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記),就可制成DNA探針,用以檢測(cè)未知樣品中是否有與其互補(bǔ)的基因序列,并可進(jìn)一步判定其與已知序列的同源程度。卿柳庭等卿柳庭等.核酸探針和PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2000,21(2)DNA探針使用方法分為3類：1.第一類稱為短針法。如果DNA靶順序鏈己知,就可以用自動(dòng)化學(xué)分析法將要判定的DNA多核苷酸互補(bǔ)、標(biāo)識(shí)。2.第二類是應(yīng)用于總的胞內(nèi)DNA探針法。這種方法要先提取然后用生物化學(xué)方法標(biāo)識(shí)。它一般不能用于區(qū)別相似的、關(guān)系密切的生物。因?yàn)樗鼈兙哂性S多相似的DNA順序(例如牛與羊)。上述兩種方法都比較簡(jiǎn)單,費(fèi)用也相對(duì)比較便宜。3.第三類方法是采用DNA重組的克隆技術(shù)。采用這種技術(shù)能得到具有高度專一性的探針,而不需有關(guān)靶順序的預(yù)先知識(shí),但比較復(fù)雜,其基本過程是首先將DNA從酶重組后的目標(biāo)物中提取出來,然后進(jìn)行克隆。當(dāng)它們大量繁殖后即被收集起來標(biāo)識(shí),再篩選出目標(biāo)DNA,以決定雜交關(guān)系。這種使用探針的方法是所選擇的最適合的方法,采用克隆雜交法進(jìn)行微生物分析的步驟為:1)讓細(xì)菌在有瓊脂的培養(yǎng)基上形成克隆體;2)無菌膜復(fù)制在皿上,從克隆體中獲取細(xì)胞,形成替代皿;3)設(shè)法將膜上的細(xì)胞DNA雙螺旋鏈打開,釋放出單一DNA鏈,然后DNA鏈被固定;4)與DNA探針互相配對(duì)具有靶順序的微生物馬上可被鑒別、計(jì)數(shù)。技術(shù)應(yīng)用： 近年來DNA探針雜交技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究十分活躍。例如，在食品微生物檢測(cè)中，大腸桿菌具有葡糖苷酸酶的特性，利用大腸桿菌中編碼該酶的基因序列作為目標(biāo)DNA，并制成DNA探針，用以檢測(cè)食品中的總大腸桿菌。DNA探針用于食品中微生物檢測(cè)的關(guān)鍵是DNA探針的構(gòu)建。為保證檢測(cè)結(jié)果的高度特異性,必須根據(jù)具體的檢測(cè)目標(biāo),構(gòu)建不同的DNA探針。構(gòu)建用于檢測(cè)食品中微生物的DNA探針的原則是,以待檢微生物中特異性保守基因序列為目標(biāo)DNA,以該序列的互補(bǔ)DNA作為雜交探針,對(duì)一般微生物而言,可以用決定該微生物特有的生理、生化特征的基因序列構(gòu)建特異性的DNA探針。 國外Moseley等利用生物素標(biāo)記的克隆沙門氏菌DNA片段作為基因探針,檢測(cè)臨床樣品、食品及飼料樣品中的沙門氏菌,敏感性為80個(gè)細(xì)菌/克。Hill等人曾用[a-32P]標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)污染食品中的產(chǎn)熱敏性腸毒素(LT)的大腸桿菌,其敏感性達(dá)100個(gè)細(xì)菌/克。國內(nèi)周志江等用生物素標(biāo)記的編碼大腸桿菌耐熱毒素(ST)的DNA片段作為探針,檢測(cè)污染食品中產(chǎn)ST的大腸桿菌。陳倩等對(duì)自食品中以血清學(xué)初篩分離出的78株ESIEC菌株,以rp-z探針檢測(cè)其HPI毒力島基因,結(jié)果檢出了7株,可鑒定為ESIEC大腸桿菌。技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法相比，基因探針技術(shù)既有其優(yōu)點(diǎn)，又有不可忽視的缺點(diǎn)。1.優(yōu)點(diǎn)：①能克服傳統(tǒng)食品微生物檢驗(yàn)方法的不足，避免了傳統(tǒng)檢測(cè)方式的種種弊端；②特異性強(qiáng)；③靈敏度高，提升了檢測(cè)的精準(zhǔn)度；④操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，簡(jiǎn)化了檢測(cè)的操作流程，優(yōu)化了檢測(cè)結(jié)果。2.缺點(diǎn)：①檢測(cè)成本高；②速度相對(duì)較慢；③效率相對(duì)較低；④放射性同位素標(biāo)記的DNA探針具有半衰期短,對(duì)人體有危害,作為常規(guī)診斷、特別是在食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中不太適用；⑤生物素標(biāo)記的DNA探針雖然對(duì)人畜無害,但生物素標(biāo)記的DNA探針在紫外線照射下易分解,同時(shí)食品中的內(nèi)源性生物素化蛋白質(zhì)和其他糖蛋白類物質(zhì)常引起背景加深和非特異性反應(yīng)；⑥菌落雜交的敏感性也受其他因素的影響。DNA探針技術(shù)