聚甲基丙烯酸縮水甘油酯修飾葡聚糖丙烯酸納米凝膠的制備及釋藥性質(zhì)研究

甲基丙烯酸甘油三酯（ma）用于裝飾葡萄糖（dex）水凝膠具有生物分解性，可以通過凝膠網(wǎng)絡(luò)控制藥物或蛋白質(zhì)的釋放。為了使葡聚糖水凝膠有更好的結(jié)腸靶向性,在前期的研究中,筆者將GMA修飾dex(dex-GMA)與丙烯酸(AAc)共聚,得到了既有pH響應(yīng)性、又有一定生物降解性及機(jī)械強(qiáng)度的新型水凝膠。為了便于臨床上應(yīng)用葡聚糖水凝膠,在本研究中筆者通過乳液聚合法制備了納米凝膠,并研究了其降解和釋藥性質(zhì)。1無酶及其衍生物的測(cè)定DexT-40,北京夏斯生物科技公司進(jìn)口分裝;甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),百靈威科技有限公司;4-(N,N-二甲氨基)吡啶(DMAP),湖南海利高新化工有限公司進(jìn)口分裝;四甲基乙二胺(TEMED),上海生工進(jìn)口分裝;紅霉素(EM),Sigma;過硫酸銨(APS)、丙烯酸(AAc)、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純,西安化學(xué)試劑廠提供;AAc經(jīng)減壓蒸餾除去阻聚劑。無酶人工胃液(SGF,1.2g氯化鈉和3.0mL濃鹽酸,水稀釋至pH值=1.2)。無酶人工腸液(SIF,磷酸二氫鉀6.8g,0.2mol·L-1氫氧化鈉190mL,水稀釋至pH值=7.4)。紫外分光光度計(jì)(BECKMAN-DU640);凍干機(jī)(FTSSYSTEMS);油電二用恒溫培養(yǎng)箱;真空干燥箱(大連第四儀表廠);恒溫水浴鍋;DF-Ⅱ型集熱式磁力攪拌器(江蘇金壇),JEM-2000EX型透射電鏡(日本Hitachi公司),納米粒度分析儀-ZetasizerNano-S(英國(guó)Malvern儀器有限公司)。所用緩沖液均用去離子水配制。2納米凝膠的制備和降解2.1葡聚糖的改性參照文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn),10gdexT-40溶解在90mLDMSO中,通氮?dú)?將DMAP2g和GMA1.46g依次加入,完全溶解后,30℃下攪拌反應(yīng)30h,反應(yīng)液滴加至400mL無水乙醇中,靜置,抽濾,得白色沉淀,沉淀溶解在4℃20mL雙蒸水中,濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7～8,于去離子水中徹底透析(4℃,4d),冷凍干燥,得白色絨毛狀產(chǎn)物即為dex-GMA。H1-NMR測(cè)定取代度(DS,每100個(gè)脫水葡糖苷單元含有甲基丙烯酸基團(tuán)的數(shù)目)。改變GMA的量可以制備不同取代度的dex-GMA。2.2Poly(dex-GMA/AAc)納米凝膠的制備自由基乳液聚合制備Poly(dex-GMA/AAc)納米凝膠。單體濃度為20%(W/V),AAc所占單體的百分比分別為0,25%,75%。AAc和dex-GMA直接加入到30mL含有0.1mL吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(pH值=8)中。600r·min-1攪拌,通氮?dú)?20min后加入1mL引發(fā)劑APS(10%,W/V),調(diào)節(jié)溫度至70℃,反應(yīng)5h。冷卻,離心分離(15000r·min-1)30min,透析,冷凍干燥得到白色粉末。2.3載藥納米凝膠的制備EM和AAc、dex-GMA一起加入含有吐溫的緩沖溶液中,其他步驟同“2.2”項(xiàng)下。2.4納米凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)考察干的納米凝膠放在氫氧化鈉溶液(pH值=8.5)中浸泡48h,冷凍干燥,測(cè)定其FTIR(ThermoNicoletAvetar370,USA)。處理后的納米凝膠粉末與溴化鉀混合壓成片。每次測(cè)定在600～4000cm-1范圍內(nèi)掃描30次,分辨率為4cm-1。2.5納米凝膠的形態(tài)透射電鏡(TEM)觀察納米凝膠的形態(tài)。樣品用磷鎢酸染色,處理后的樣品放在銅網(wǎng)上,室溫下干燥,觀察其形態(tài)。2.6包裹率和載藥率測(cè)定本實(shí)驗(yàn)中制備的納米凝膠不能完全降解,而且EM在乙醇中的溶解度較大。參考文獻(xiàn),測(cè)定其載藥率和包裹率。干的載藥納米凝膠分散在乙醇中,室溫下快速攪拌使EM充分釋放并溶解在乙醇中。用微孔濾膜(100kD)過濾乙醇溶液除去納米凝膠,紫外可見分光光度計(jì)(BECKMAN-DU600)在波長(zhǎng)236nm下,測(cè)定濾液中EM的含量,即為納米凝膠中包裹的EM量。包裹率和載藥率計(jì)算公式如下:載藥率(%)=(納米凝膠中的含藥量/納米凝膠的質(zhì)量)×100%,包裹率(%)=(納米凝膠中的含藥量/投藥量)×100%。2.6納米凝膠的降解稱取5份一定質(zhì)量的納米凝膠(不同DS,AAc和dex-GMA質(zhì)量比),分別分散在5mL葡聚糖酶(0.1U·mL-1)磷酸鹽緩沖液(pH值=7.4)中,倒入透析袋中,在(37.0±0.1)℃下,30mLpH值=7.4磷酸鹽緩沖液中100r·min-1攪拌。分別在2,4,6,12,24d后冷凍干燥透析袋中的溶液,稱重。納米凝膠的降解通過質(zhì)量損失評(píng)價(jià),計(jì)算公式如下:質(zhì)量損失(%)=(Wi-Wt)/W×100%。Wi為放入緩沖液之前的質(zhì)量,Wt為冷凍干燥之后的質(zhì)量。2.7粒度分布激光粒度分析儀(ZetasizerNano-ZS90,Malven英國(guó))測(cè)定納米凝膠在不同pH值下的粒徑分布。測(cè)定之前,納米凝膠分散在SGF,SIF浸泡24h。2.8體外釋藥特性研究動(dòng)態(tài)透析法測(cè)定納米凝膠的體外釋藥,稱取0.5g載藥納米凝膠放在透析袋中,放入50mLSGF,100r·min-1攪拌同時(shí),保持溫度(37±0.1)℃,分別在1,2h后用移液管取出2.0mL,同時(shí)補(bǔ)進(jìn)同體積的溶液。把裝有納米凝膠的透析袋繼續(xù)放入含葡聚糖酶(0.1U·mL-1)的SIF中,100r·min-1攪拌,同時(shí)保持溫度(37±0.1)℃。一定的時(shí)間間隔,用移液管取出2.0mL,同時(shí)補(bǔ)進(jìn)同體積的溶液。釋放的藥物濃度用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)236nm處測(cè)定。3結(jié)果3.1納米凝膠的制備表面活性劑吐溫在水中形成膠束,引發(fā)劑在70℃下形成過硫酸銨自由基,引發(fā)dex-GMA和AAc的聚合。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,分子鏈在增長(zhǎng),疏水性增強(qiáng),溶解度變小,到達(dá)臨界鏈長(zhǎng)后進(jìn)入表面活性膠束中形成納米凝膠。AAc,dex-GMA易溶于水,反應(yīng)前的溶液是均相透明的,隨著納米凝膠的生成溶液變成兩相乳白色溶液。透射電鏡下觀察制備的納米凝膠粒徑均勻、形態(tài)圓整、分散性良好。3.2納米凝膠的性質(zhì)3.2.1納米凝膠的ftir納米凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)用FTIR來表征。dex-GMA上的羰基(C=O)伸縮振動(dòng)的峰值在1721cm-1。為了區(qū)分羰基和羧基,納米凝膠放在NaOH溶液(pH值=8.5)中浸泡48h后測(cè)定其FTIR。羧基在1730cm-1的峰消失,同時(shí)在約1571cm-1處出現(xiàn)一個(gè)峰為丙烯酸鈉(–COONa)。3.2.2納米凝膠的生成在本試驗(yàn)中,EM通過物理包裹進(jìn)入納米凝膠里,其包裹率和載藥率分別是90.7%,1.06%。表面活性劑吐溫的加入使難溶于水的EM進(jìn)入表面活性劑的膠束,增加了溶解度。同時(shí)如“2.1”所述,達(dá)到臨界鏈長(zhǎng)的聚合物進(jìn)入膠束中形成納米凝膠。因此,在聚合反應(yīng)進(jìn)行的過程中EM被包裹進(jìn)了納米凝膠。3.2.3取代度、質(zhì)量比對(duì)納米凝膠的降解速率制備的葡聚糖納米凝膠在SIF中葡聚糖酶存在的條件下可部分降解。如圖2所示,6d內(nèi)不同DS(7,10,13)的納米凝膠(25/75,W/W)的降解速率分別為35%,15%,12%;不同dex-GMA/AAc質(zhì)量比(75/25,25/75,W/W)的納米凝膠(DS7)的降解速率分別為30.4%,18.0%。這些結(jié)果表明取代度、質(zhì)量比對(duì)納米凝膠的降解有顯著的影響,主要原因是交聯(lián)密度引起的。隨著dex-GMA/AAc質(zhì)量比的減小和DS的增加,雙鍵數(shù)目增多,AAc和dex-GMA的聚合程度變大,從而交聯(lián)密度增加導(dǎo)致降解速率減小。3.2.4氫鍵形成氫鍵圖3顯示納米凝膠在SGF、SIF中的粒度分布。在SGF,AAc中的羧基質(zhì)子與dex-GMA上的羥基氧相互作用形成氫鍵,這種絡(luò)合作用導(dǎo)致納米凝膠收縮,納米凝膠的粒徑正態(tài)分布的峰值大約在60nm(圖3a)。在SIF,隨著羧基的離子化,氫鍵斷開親水性增強(qiáng),納米凝膠溶脹,粒徑正態(tài)分布的峰值大約在256nm(圖3b)。隨著pH值的變化,納米凝膠有明顯的溶脹,因此Poly(dex-GMA/AAc)納米凝膠具有酸敏特性。3.2.5不同ph值對(duì)納米凝膠釋放的影響圖4顯示了Poly(dex-GMA/AAc)納米凝膠的釋藥曲線。2h后,在SGF中納米凝膠釋放大約7%EM;之后在含葡聚糖酶的SIF中,4h內(nèi)釋放量增加至約37%。制備的納米凝膠在胃液(pH值<3)的溶脹率小,釋放的EM量少;隨著pH值的增高,羧基離子化,納米凝膠的溶脹率變大,并且在結(jié)腸中存在葡聚糖酶使其降解,釋放的EM量有明顯的增加。Poly(dex-GMA/AAc)納米凝膠在胃液中釋放的藥量少,從而能夠保護(hù)EM通過胃部,到達(dá)腸部溶脹和降解的雙重作用,釋放藥物量增大。因此制備的Poly(dex-GMA/AAc)納米凝膠具