刺激性、過敏性和溶血性的方案設(shè)計和實施.內(nèi)容概述1刺激性實驗2過敏性實驗3溶血性實驗41概述化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性：指化學(xué)藥物制劑經(jīng)眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動脈、肌肉、皮下、靜脈旁和鞘內(nèi)等非口服途徑給藥，對用藥局部產(chǎn)生的毒性(如刺激性和過敏性等)和/或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性(如過敏性和溶血性等)。它是臨床前安全性評價的組成部分。刺激性實驗實驗?zāi)康模河^察動物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)，為臨床用藥提供安全性依據(jù)。實驗分類：皮膚刺激性實驗；

注射給藥部位的刺激性實驗；眼刺激性實驗；皮膚光毒性（光刺激性）實驗刺激性實驗實驗設(shè)計：

Ⅰ實驗動物的選擇：依據(jù)實驗?zāi)Ｐ秃陀^察指標(biāo)選擇實驗動物，一般每個實驗選擇一種動物；

Ⅱ給藥頻率與期限：依據(jù)擬定臨床應(yīng)用情況來決定。重復(fù)給藥的制劑，一般每天給藥一次，給藥期限最長不超過4周。單次給藥的制劑可用單次給藥的方法進行實驗；

Ⅲ可逆性觀察：建議進行停藥后恢復(fù)期的觀察；刺激性實驗實驗設(shè)計：

Ⅳ

受試物的選擇：應(yīng)與臨床應(yīng)用制劑一致；

Ⅴ

對照組：以溶媒和/或賦形劑作為陰性對照。必要時采用已上市制劑作對照；

Ⅵ

劑量：一般采用與臨床制劑相同濃度，設(shè)一個劑量組，必要時應(yīng)該進行不同濃度的刺激性實驗；

Ⅶ給藥方案：原則上應(yīng)與臨床用藥方案一致，但設(shè)計給藥容積、速率和頻率時，應(yīng)考慮所選用動物模型給藥部位的解剖和生理特點。皮膚刺激性實驗適用范圍：經(jīng)皮給藥制劑及可能接觸皮膚的非口服給藥制劑應(yīng)考慮進行皮膚刺激性實驗。實驗動物：首選家兔，雌雄各半，每組4-8只。實驗方法：⑴設(shè)賦形劑對照,采用同體左右側(cè)自身對法；⑵實驗前24小時對給藥區(qū)（通常在背部）進行脫毛處理，去毛范圍左右各3cm×3cm；⑶取受試物0.5ml直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側(cè)涂布賦形劑作對照。貼敷時間至少4小時；⑷貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水或無刺激性溶劑清潔給藥部位；⑸多次給藥應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，期限一般不超過4周皮膚刺激性實驗結(jié)果觀察：單次給藥：在去除藥物后30-60min，24、48和72小時在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察并按表1給出的評分標(biāo)準記錄涂覆部位有無紅斑和水腫等情況；多次給藥：在每次去除藥物后1小時以及再次貼敷前在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察并按表1給出的評分標(biāo)準記錄涂覆部位是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發(fā)生時間及消退時間，并對紅斑及水腫進行評分；末次貼敷后，在去除藥物后30-60min，24、48和72小時肉眼觀察并按表1給出的評分標(biāo)準記錄涂覆部位有無紅斑和水腫等情況；皮膚刺激性實驗表1.皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準皮膚刺激性實驗結(jié)果評價：單次給藥：計算每一觀察時間點各組受試物及賦形劑皮膚反應(yīng)積分的平均分值，按表2進行刺激強度評價；多次給藥：首先計算每一觀察時間點各組積分值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物積分均值，按表2進行刺激強度評價；皮膚刺激性實驗表2.皮膚刺激強度評價標(biāo)準

注射給藥部位刺激性實驗適用范圍：注射劑應(yīng)考慮進行注射給藥部位刺激性實驗。實驗動物：首選家兔，每組動物數(shù)不少于3只。實驗方法：⑴應(yīng)設(shè)生理鹽水對照,采用同體左右側(cè)自身對法；⑵用藥部位根據(jù)藥物的給藥途徑確定，可選用耳緣靜脈、耳中心動脈、股和背部肌肉、靜脈旁組織等；⑶一般按臨床給藥方案給予受試物，多次給藥一般不超過7天；注射給藥部位刺激性實驗結(jié)果觀察及評價：單次給藥：給藥后48-96小時對動物和注射部位進行肉眼觀察多次給藥：⑴每天給藥前以及最后一次給藥后48-96小時對動物和注射部位進行肉眼觀察；⑵觀察期結(jié)束時應(yīng)對部分動物進行給藥部位組織病理學(xué)檢查；⑶留下的動物根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14-21天再進行組織病理學(xué)檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度；根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果進行綜合判斷。眼刺激性實驗適用范圍：眼用藥物及可能接觸眼睛的受試物均應(yīng)考慮進行眼刺激性實驗。實驗動物：首選家兔，每組動物數(shù)不少于3只。實驗方法：⑴應(yīng)設(shè)生理鹽水對照,采用同體左右側(cè)自身對法；⑵每只眼睛滴入0.05-0.1ml或涂敷0.1g受試物，然后輕合眼瞼約10秒，一般不需沖洗眼睛；⑶多次給藥時每天給受試物的次數(shù)應(yīng)與臨床用藥頻率相同，連續(xù)給受試物2-4周，一般不超過4周；眼刺激性實驗結(jié)果觀察：單次給藥：在給藥后1、2、4、24、48和72小時對眼部進行檢查；多次給藥：每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時對眼部進行檢查，如果在72小時未見任何刺激癥狀，實驗即可結(jié)束，如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限，但一般不超過21天；一般采用裂隙燈檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其它合適器械（如放大鏡、生物顯微鏡等）。在整個觀察過程中應(yīng)進行熒光素染色檢查。每次檢查，都應(yīng)按表3記錄眼部反應(yīng)的分值。眼刺激性實驗表3.眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準

眼刺激性實驗表3.眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準

眼刺激性實驗結(jié)果評價：按表3的要求，將每一個觀察時間每一動物的眼角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)分值相加得總積分，將一組的積分總和除以動物數(shù)，即得最后分值；按表4判斷其刺激程度。表4眼刺激性評價標(biāo)準皮膚光毒性實驗實驗動物：成年白色豚鼠，雌雄各半，每組動物數(shù)至少6只。實驗方法：實驗分組：應(yīng)設(shè)陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組。陰性對照組應(yīng)給予賦形劑或溶媒，陽性對照組給予8-甲氧基補骨脂素，受試物低劑量組給予臨床用藥濃度，高劑量組給予不引起皮膚刺激反應(yīng)的濃度UV光源：波長為320-400nm的UVA，用前需用輻射計量儀在實驗動物背部照射區(qū)設(shè)6個點測定光強度（mw/cm2)，以平均值計。照射劑量為10J/cm2。照射時間（秒）=照射劑量（10000mJ/cm2）/光強度（mJ/cm2·sec）皮膚光毒性實驗實驗步驟：進行正式光毒實驗前18-24小時，將動物脊柱兩側(cè)皮膚去毛，實驗部位皮膚需完好，無損傷及異常。備4塊去毛區(qū)，每塊去毛面積約為2cm×2cm。將動物固定，按表5所示，在動物去毛區(qū)1和2涂敷0.2ml(g)受試物或陽性對照藥，3和4涂敷同體積(量)的賦形劑或溶媒。給藥30min后，左側(cè)用鋁箔覆蓋，膠帶固定，右側(cè)用UVA進行照射。結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表6判定每只動物皮膚反應(yīng)評分。皮膚光毒性實驗按表5判斷其刺激程度。表5動物去毛區(qū)的試驗安排皮膚光毒性實驗按表6判斷其刺激程度。表6皮膚反應(yīng)的評分標(biāo)準皮膚光毒性實驗結(jié)果評價：

單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和為2或2以上的動物數(shù)為1只或1只以上時，判為受試物具有光毒性。

過敏性實驗實驗?zāi)康模河^察動物接觸受試物后是否產(chǎn)生全身或局部過敏反應(yīng)，為臨床用藥提供安全性依據(jù)。實驗分類：經(jīng)皮給藥過敏性實驗：豚鼠最大化實驗（GPMT）和Buehler實驗（BT）注射給藥過敏性實驗：被動皮膚過敏實驗（PCA）和全身主動過敏實驗（ASA）被動皮膚過敏實驗實驗動物：常用的動物是大鼠，亦用小鼠、豚鼠。實驗分組：陰性對照組：同體積的溶媒；陽性對照組：卵白蛋白1-5mg/只；受試物低劑量組：臨床最大劑量(/kg或m2)；受試物高劑量組：低劑量的數(shù)倍量。每組動物數(shù)至少6只。被動皮膚過敏實驗實驗方法：致敏：抗體的制備：選擇容易產(chǎn)生抗體的給藥方法，如靜脈、腹腔或皮下注射等，隔日一次，共3-5次。末次致敏后10-14天左右采血，2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離血清，-20℃保存，2周內(nèi)備用。被動致敏：上述各組抗血清應(yīng)根據(jù)反應(yīng)特點決定稀釋倍數(shù)，一般用生理鹽水稀釋成1：2、1：4、1：8、1：16或1：32等。在動物背部預(yù)先脫毛3×4cm2的皮內(nèi)注射各對應(yīng)組的抗血清0.1mL，進行被動致敏。被動皮膚過敏實驗實驗方法：激發(fā)：被動致敏24或48小時后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的0.5-1%伊文思蘭染料共1mL，進行激發(fā)。結(jié)果測定：30分鐘后麻醉處死各組動物，剪取背部皮膚，測量皮膚內(nèi)層的斑點大小，直徑大于5mm者判定為陽性。不規(guī)則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半。全身主動過敏實驗實驗動物：通常選用體重為300-400克的豚鼠。實驗分組：陰性對照組：同體積的溶媒；陽性對照組：卵白蛋白1-5mg/只；受試物低劑量組：臨床最大劑量(/kg或m2)；受試物高劑量組：低劑量的數(shù)倍量。每組動物數(shù)至少6只。全身主動過敏實驗實驗方法：致敏：選擇容易產(chǎn)生抗體的給藥方法，如靜脈、腹腔或皮下注射等，隔日一次，共3-5次。

激發(fā)：激發(fā)途徑：一次快速靜脈內(nèi)給藥激發(fā)次數(shù)：末次注射后第10-14日一次激發(fā)激發(fā)劑量：一般為致敏劑量的2-5倍量，給藥容積1-2ml全身主動過敏實驗實驗方法：觀察指標(biāo)：致敏期間：每日觀察每只動物的癥狀。初次，末次致敏和激發(fā)當(dāng)日測定每組每只動物的體重。激發(fā)：靜脈注射后立刻至30分鐘，按表7癥狀詳細觀察每只動物的反應(yīng)，癥狀的出現(xiàn)及消失時間。最長觀察3小時。全身主動過敏實驗按表7觀察其過敏癥狀。表7過敏反應(yīng)癥狀全身主動過敏實驗結(jié)果評價：

可按表8判斷過敏反應(yīng)發(fā)生程度。計算過敏反應(yīng)發(fā)生率。根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進行綜合判斷。注意事項：激發(fā)注射后，若發(fā)現(xiàn)有過敏反應(yīng)癥狀時，可取健康未致敏豚鼠2只，自靜脈注射激發(fā)劑量的受試物，觀察有無由于受試物作用引起的類似過敏反應(yīng)癥狀，以供結(jié)果判斷時參考。全身主動過敏實驗按表8判斷其過敏反應(yīng)發(fā)生程度。表8全身致敏性評價標(biāo)準溶血性實驗實驗?zāi)康模河^察受試物是否能夠引起溶血和紅細胞凝聚等反應(yīng)，為臨床用藥提供安全性依據(jù)。適用范圍：凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進行溶血性實驗。溶血性實驗實驗方法：血細胞懸液的配制：取兔血（或羊血）數(shù)毫升，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10分鐘，或用玻璃棒攪動血液，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，1000-1500r/min離心15分鐘，除去上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌2-3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液配成2％的混懸液，供