《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》測定酸性蛋白酶活力的探討

作為一種飼料添加劑，酸性葡萄酶在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用非常普遍。這可以補(bǔ)充動物胃腸道中酸性葡萄酶的不足和不足，提高動物對飼料的消化利用率。同時，酸性葡萄酶可以顯著促進(jìn)幼種肥力的生長發(fā)育，減少斷奶引起的壓力。因此,酸性蛋白酶是一種應(yīng)用前景十分廣闊的飼料添加劑。酶活力是衡量酶生物催化活性的一個重要指標(biāo),但我國目前尚無飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶活力測定的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),市場上出現(xiàn)的該類產(chǎn)品其企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)大多采用中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》(QB/T1803-1993)來檢測產(chǎn)品中酸性蛋白酶的活力。筆者在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn),直接用該方法檢測飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶的活力收率甚低。為此,本文就《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》測定飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶的活力進(jìn)行試驗(yàn)研究,以期找到有效的檢測方法,為飼用酶添加劑預(yù)混料產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供檢測依據(jù),為制定國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。1試驗(yàn)材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1原料的混合與成酶制劑(試樣Ⅰ、試樣Ⅱ)由酸性蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和玉米粉載體按一定比例混合而成,所使用酶制劑原料均由肇東市日成酶制劑有限公司生產(chǎn)。1.1.2試劑的類型乳酸(80%～90%)、乳酸鈉(70%)、碳酸鈉、三氯乙酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸(85%)、鹽酸、硫酸鋰、濃溴水(99%)、干酪素(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、L-酪氨酸(Sigma公司)(所用試劑未加注明均為分析純)。1.1.3不同試劑的配制酪素溶液(10g/L)、L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)、乳酸緩沖溶液(pH3.0)、三氯乙酸溶液(0.4mol/L)、碳酸鈉溶液(0.4mol/L)、福林試劑等均按QB/T1803-1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》<附錄A酶活力的試驗(yàn)方法>A3.2福林法(第一法)之規(guī)定制備。1.2溫度、分光光度計分析天平:感量為0.0001g;恒溫水浴搖床:溫控30～60℃±0.1℃;秒表;移液槍(精度10μL);分光光度計(北京普析通用儀器公司,TU-1901);離心機(jī)(6000rpm)。1.3測試方法1.3.1酸性酶活性物質(zhì)的定義在40℃和一定的pH條件下,1min水解酪素生成1μg酪氨酸所需的酶量,定義為一個酶活力單位,以U表示。1.3.2酶解過程中樣品的制備以QB/T1803-1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》<附錄A酶活力的試驗(yàn)方法>A3.2福林法(第一法)為基礎(chǔ),將A3.2.4.2測定“(1)待測酶液的制備”中“用四層紗布過濾,濾液……”步驟用“取適量6000rpm(1200×g)離心10min,取上清液……”替代。以下步驟同A3.2.4.2測定之“(2)測定”。之所以對該部分進(jìn)行修改,是因?yàn)殡x心是當(dāng)前樣品分離普遍采用的手段,其優(yōu)點(diǎn)是方便快捷、分離效果好。1.3.3待測酶液的制備在QB/T1803-1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》<附錄A酶活力的試驗(yàn)方法>A3.2福林法(第一法)的基礎(chǔ)上將其中A3.2.4.2測定之“(1)待測酶液的制備”修改為:精密稱取酶粉適量置研缽中,用少許乳酸緩沖液濕潤,用力研磨數(shù)分鐘,加入適量乳酸緩沖溶液混勻,靜置,將上層清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,沉渣部分繼續(xù)研磨數(shù)分鐘,再用少量緩沖液溶解,將上層清液轉(zhuǎn)移至容量瓶中,如此反復(fù)3～4次,最后將試樣全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中,用緩沖溶液定容至刻度,搖勻(酶活力應(yīng)控制在8～10U/mL范圍內(nèi)),此混懸溶液直接供測試用。以下步驟同A3.2.4.2測定之“(2)測定”。2結(jié)果與分析2.1酸性蛋白酶原料活力測定為了確定試驗(yàn)樣品中酸性蛋白酶的理論含量,按照1.3.2《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》對試驗(yàn)用酸性蛋白酶原料的活力進(jìn)行測定,其測量結(jié)果見表1。根據(jù)表1平均含量結(jié)果計算,試驗(yàn)樣品Ⅰ中酸性蛋白酶理論含量為958U/g,試驗(yàn)樣品Ⅱ中理論含量為826U/g。2.2工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法為了檢驗(yàn)《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》對飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶活力測定的適用性,按照1.3.2《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》對試驗(yàn)樣品Ⅰ和試驗(yàn)樣品Ⅱ的酸性蛋白酶活力進(jìn)行測定,測量結(jié)果見表2。表2結(jié)果顯示,《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》的回收率只有70%左右。表明,《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》不適用于飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶活力的測定。這說明其他酶的存在可能是造成酸性蛋白酶活力測定回收率低的因素之一。2.3酸性蛋白酶活力測定為了弄清酸性蛋白酶的活力測定是否受其他酶存在的影響,我們設(shè)計了以下試驗(yàn),將玉米粉、酸性蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶原料分別制成一定濃度的單一溶液,再按照1.3.2《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》測定不同組合的混合酶液(按照試驗(yàn)樣品中酶的濃度進(jìn)行配比)中酸性蛋白酶的活力。測量結(jié)果見表3。從表3測量結(jié)果可以看出,無論雙酶、三酶、四酶還是五酶組合,其酸性蛋白酶活力測定結(jié)果相差不大,與同次試驗(yàn)中原料酶活力測定結(jié)果93055U/g基本一致,酶活力并沒有明顯的降低。表明在酸性蛋白酶活力的測定中其他酶的存在不會影響酸性蛋白酶活性的發(fā)揮,先前的推測是不成立的。2.4最佳載體的確定結(jié)果一次偶然事件發(fā)現(xiàn),沒有經(jīng)過離心處理的試樣上清液的酶活力測定值高于離心上清液的測定值,進(jìn)一步試驗(yàn)顯示不經(jīng)離心處理的混懸液測定值更高。分析認(rèn)為,載體的吸附作用可能是主要的影響因素。為此,對原方法進(jìn)行修改產(chǎn)生了1.3.3《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》改進(jìn)方法。按照改進(jìn)方法對試驗(yàn)樣品Ⅰ和試驗(yàn)樣品Ⅱ中酸性蛋白酶活力進(jìn)行測定,測量結(jié)果見表4。從表4的結(jié)果可以看出,《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》改進(jìn)方法的回收率在93%～99%之間。這一結(jié)果表明,載體對酸性蛋白酶的確存在著較強(qiáng)的吸附作用,并且這種吸附不會影響酸性蛋白酶活性的發(fā)揮;同時也證明《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》改進(jìn)方法可以作為飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶活力測定的檢測方法。2.5白酶原料檢測在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶活力的測定中樣品空白吸收度值偏高,為了查清原因,筆者以酪素以及用其他酶代替酪素作底物,用1.3.2《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》對酸性蛋白酶原料進(jìn)行樣品和樣品空白吸收度值測定,測量結(jié)果見表5。從表5數(shù)據(jù)可以看出,一方面,酪素和以纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶為底物的樣品、樣品空白的吸收度值都很低,且以纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶為底物的樣品和樣品空白吸收度值基本一致,說明這些酶雖然也是一種蛋白質(zhì),但是酸性蛋白酶對他們沒有酶解作用,或者雖然有酶解作用,但不生成酪氨酸和含有酚基的其他氨基酸或者這類氨基酸的生成量很少。另一方面,以淀粉酶為底物的樣品和樣品空白吸收度值都比較高,且基本相同,表明酸性蛋白酶對淀粉酶也沒有酶解作用,但淀粉酶本身可能含有酪氨酸或者其組成氨基酸中含有酚基。3飼用酶添加劑預(yù)混料中酸性蛋白酶活力測定在飼用酶添加劑預(yù)混料的酸性蛋白酶活力測定中,其他酶對酸性蛋白酶活力的測定沒有太大的影響,其影響可以忽略。在飼用酶添加劑預(yù)混料的酸性蛋白酶活力測定中,載體對蛋白酶存在著很強(qiáng)的吸附能力,處理不當(dāng)會影響酸性蛋白酶活力的測定;直接用試樣混懸液進(jìn)行測定是飼用酶添加