生姜有效成分在脾胃虛寒組大鼠組織分布及歸經的研究

中醫(yī)的經絡理論是歷代醫(yī)家根據中醫(yī)理論和中醫(yī)療效來總結的。它是中醫(yī)理論體系的重要組成部分。中藥歸經理論的現代研究始于50年代,主要工作為整理古籍文獻資料,對歸經的含意、起源、發(fā)展、分類、臨床應用及存在問題進行探討。盡管在歸經上仍處于探索階段,但卻是有意義的嘗試。目前關于中藥歸經的研究方法一般從文獻研究、臨床研究和實驗研究3個方面進行,其中研究最多的當屬實驗研究。文獻研究是從五味、四氣、臟腑、經絡、解剖部位、藥理作用等多方面考證與分析歸納文獻。實驗研究主要從藥理效應及作用部位、有效成分體內分布及代謝過程、微量元素體內分布、受體、環(huán)核苷酸體內濃度變化、載體學說、蛋白質組學等方面進行。上述研究,從不同的角度驗證了歸經理論的客觀性和科學性。尤其是中藥有效成分臟腑組織分布與歸經的研究。據報道,與傳統(tǒng)歸經的吻合率達到87%,表明中藥歸經與其有效成分的臟腑組織分布之間有密切的聯系。施懷生等運用統(tǒng)計學的方法對32種中藥歸經情況及其藥物體內代謝過程的關系進行分析,提出了藥物動力學的總體情況及吸收、分布、排泄各環(huán)節(jié),均與該藥物的歸經密切相關,藥物在各臟腑所對應器官內的血藥濃度,可直接反應藥物歸經的基本情況。因此,以中藥功效物質為對象,采用藥物動力學方法研究歸經,具有可行性。中醫(yī)藥學是基于病理條件下形成和建立的。歸經的認識,離不開藥物的作用和特定的病理環(huán)境。因此,開展歸經的現代研究,在充分利用現代科技手段的同時,應該與中醫(yī)病證和中藥藥效結合起來,才能獲得符合中醫(yī)認識的結果。綜合上述認識,筆者提出“中醫(yī)病證-藥效-藥代動力學”結合研究中藥歸經的系統(tǒng)方法。即在中醫(yī)病證模型上,觀察藥效,并采用藥動學方法研究藥物在臟腑組織的分布。通過藥物在臟腑組織分布,認識中藥的歸經。生姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鮮根莖。性辛,微溫。歸肺、脾、胃經。主要有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、解魚蟹毒的作用,主要用于風寒感冒、胃寒嘔吐、寒痰咳嗽、魚蟹中毒。生姜的化學成分復雜,現已發(fā)現100多種,包括揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷和黃酮類等,其中揮發(fā)油主要為單萜類物質;姜辣素中有姜酚類,姜烯酚類,姜酮類;二苯基庚烷主要為線性二苯基庚烷類和環(huán)狀二苯基庚烷類化合物,姜辣素不僅是生姜特征性風味的主要呈味物質,也是生姜多種藥理作用的主要功能因子,姜辣素中的姜酚是生姜的主要生物活性成分,生姜的多種藥用價值也是因為姜酚在起作用,姜酚中又以6-姜酚濃度最高,其生物活性也最強,因此6-姜酚常作為評價生姜的客觀指標。目前,對生姜化學成分分析、有效成分提取、藥理作用研究等方面均取得了較大進展,但有關生姜歸經的研究報道很少。本研究在中醫(yī)藥理論的指導下,基于中醫(yī)病癥模型,采用藥代動力學方法,觀察生姜的有效成分在大鼠的血液和體內組織分布情況,探討生姜有效成分體內分布生姜歸經的相關性。1材料和方法1.1姜酚、姜烯酚生姜,為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖,市售,經河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定為正品。6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚:由河南省中醫(yī)藥研究院惠贈;生理鹽水:河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司,批號:12020605B;甲醇(色譜純):迪馬科技有限公司;其他試劑均為市售分析純。1.2儀器、檢測方法低速離心機:上海安亭科學儀器廠;AE240電子分析天平:瑞士梅特勒儀器有限公司;Waters2695高效液相色譜儀:美國Waters公司;Waters2996二極管陣列檢測器:美國Waters公司;Empower色譜工作站:美國Waters公司;AE240電子分析天平:瑞士梅特勒儀器有限公司;TGL-16gR型高速冷凍離心機:上海安亭科學儀器廠;XK96型快速混勻器:中國姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司;AE240十萬分之一分析天平:瑞士梅特勒儀器有限公司;KQ3200B超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。1.3動物飼養(yǎng)及管理SPF級Wistar大鼠,體質量(300±10)g,雄性,分籠飼養(yǎng)在(20±2)℃的動物室,專人飼養(yǎng)和管理;實驗鼠喂養(yǎng)飼料為標準全價飼料,購買于鄭州大學醫(yī)學院動物實驗中心;合格證號:SCXK(豫)2010-0002。1.4實驗方法1.4.1-1制備5倍量水取生姜,切碎,取碎末1.8kg放入不銹鋼容器內,第一次加入5倍量水煎煮40min,濾過,濾液待用;殘渣加入3倍量水煎煮30min,濾過,合并兩次濾液經過低速離心機離心后濃縮至300mL備用,即得3g·mL-1生姜水煎液。1.4.2灌胃4攝食脾胃虛寒動物模型:大鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫保持在20℃左右,不限食水飼養(yǎng)3d后開始每天上午按照10mL·kg-1的量給模型組大鼠灌胃4℃食醋,連續(xù)造模10d。1.5姜的溫和實驗1.5.1連續(xù)給藥大鼠質量指標30只雄性大鼠,室溫保持在20℃左右,不限食水飼養(yǎng)3d后隨機分為3組,空白組、模型組及正常給藥組各10只,各組大鼠禁食不禁水24h后,稱質量,標記。每天上午造模,空白組灌胃生理鹽水10mL·kg-1;模型組和正常給藥組按1.4.2項下方法造模,第6天下午正常給藥組大鼠按劑量開始灌胃給藥,給藥體積均為10mL·kg-1,連續(xù)給藥5d。實驗期間,觀察動物外觀行為變化,并每天記錄大鼠體質量、進食量變化。1.5.2一般觀察1.6姜的組織分布實驗和藥物動力學參數的分析1.6.1模型的造模及給藥30只雄性大鼠,隨機選4只作為空白組,用于取血及組織標本;剩下的大鼠隨機分為兩組,每組13只,一組為正常給藥組,另一組按照1.4.2項下方法造模為模型組,所有大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)24h后分別進行實驗。模型組及正常給藥組分別在灌胃給藥(生姜水煎液)后5min、10min、15min、20min、25min、30min、45min、60min、90min、120min、150min摘除眼球取血,置10mL的離心管中,備用;斷頭處死,迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸和腦,均按1.6.2項下的方法處理。1.6.2組織病理學檢測血清樣品4000r·min-1離心8min分離血清,精密吸取上清液1mL置于10mL具塞試管中,加入甲醇4mL,漩渦振蕩5min,6000r·min-1離心20min,取3mL上清液;剩余再加入4mL甲醇,方法同上,合并2次的上清液,氮氣吹干,殘余物加入2mL甲醇定容,過0.45μL微孔濾膜過濾,進樣。完整取出各組織,用生理鹽水洗去表面浮血,吸干精密稱取質量,放入離心管,于-20℃保存,測定前取出該組織樣品,按2mL·g-1的比例加入生理鹽水制成組織勻漿液,勻漿液加入2倍體積的分析甲醇,漩渦振蕩10min,6000r·min-1離心20min,取上清液;殘渣再加入2倍體積的甲醇,方法同上,合并2次的上清液,氮氣吹干,殘余物加入2mL甲醇定容,過0.45μL微孔濾膜進樣。1.6.3流動相及紫外檢測波長l色譜柱:DikmaplatisilODSC18(5μm,250.0mm×4.6mm);流動相:A為水,B為甲醇;洗脫梯度見表1;流速:1mL·min-1;柱溫:30℃;紫外檢測波長:227nm;進樣量:20μL。見表1。1.6.4標品溶液的制備精密稱取6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚各1.01mg、0.13mg、0.12mg標準品,于10mL容量瓶中,加適量甲醇使其充分溶解,加甲醇至刻度,然后再各抽取1mL混合加入適量甲醇至刻度。再分別依次稀釋成6-姜酚濃度分別為0.505mg·L-1、1.01mg·L-1、2.02mg·L-1、5.05mg·L-1、10.1mg·L-1、20.2mg·L-1、50.5mg·L-1、101mg·L-1,8-姜酚濃度分別為0.06mg·L-1、0.12mg·L-1、0.24mg·L-1、0.60mg·L-1、1.20mg·L-1、2.40mg·L-1、6.00mg·L-1、12.00mg·L-1,6-姜烯酚濃度分別為0.065mg·L-1、0.130mg·L-1、0.260mg·L-1、0.650mg·L-1、1.300mg·L-1、2.600mg·L-1、6.500mg·L-1、13.000mg·L-1的系列標準品溶液,4℃冷藏避光貯藏備用。1.6.5保留時間的確定在上述色譜條件下,空白血清中和正常組織液中6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚峰形良好,不受內源性雜質峰干擾,保留時間分別為:18.3min、41.5min、43.5min。1.6.6提取和測定血清樣品分別量取1.6.4系列濃度的標準品溶液100μL,置具塞離心管中,50℃水浴,氮氣吹干,再分別加入正常組織100μL至上述離心管中,制備成系列相應濃度的含藥血清樣品溶液,按1.6.2項下生物樣品處理方法提取處理后分別進樣,進行色譜分析。用待測物濃度(C)為橫坐標,待測物峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸,求得各組織、各標準樣的標準曲線R值均大于0.99,各組織在不同范圍內線性關系良好,符合分析測定要求。1.6.7提取回收率測定結果分別取相應低、中、高濃度的混合標準品溶液100μL,每個濃度平行做6份,置具塞離心管中,50℃水浴,氮氣吹干,再分別加入血清和正常組織勻漿液100μL至上述離心管中,制備成相應濃度的混標樣品組織液,按1.6.2項下的生物樣品處理方法提取處理后分別進樣,記錄峰面積并按回歸方程計算藥物濃度。由測定結果可知,該方法測得各組織中3種標準品的提取回收率為58%~72%;方法回收率為93%~113%,符合生物樣品分析的質量控制要求。1.6.8提取藥物濃度分別取相應低濃度、中濃度、高濃度的混合標準品溶液100μL(各2份),置具塞離心管中,50℃水浴,氮氣吹干,再分別加入血清和各正常組織勻漿液100μL至上述離心管中,制備成相應濃度的混標樣品組織液,按1.6.2項下生物樣品處理方法提取處理后,其中一組用來每天內連續(xù)測定3次,另一組每天進樣1次連續(xù)測定3d,記錄峰面積并按回歸方程計算藥物濃度。由測定結果可知,所有樣品的日內RSD和日間RSD均小于10%,精密度良好,符合生物樣品的質量控制要求。1.6.9提取藥物濃度分別取相應低、中、高濃度的混合標準品溶液100μL(各2份),置具塞離心管中,50℃水浴,氮氣吹干,再分別加入血清和各正常組織勻漿液100μL至上述離心管中,制備成相應濃度的混標樣品組織液,按1.6.2項下的生物樣品處理方法提取處理后,一組用來測定12h后樣品,另一組用來測定24h后樣品,記錄峰面積并按回歸方程計算藥物濃度。由測定結果可知,所有樣品的日內RSD和日間RSD均小于10%,精密度良好,符合生物樣品的質量控制要求。1.7統(tǒng)計方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,計數資料采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1造模成功的原因結果顯示,模型組和生姜組與空白對照組比較,造模大鼠表現為倦臥少動,反應遲鈍,唇色蒼白,捉拿時反抗無力,漸見體型瘦弱,可見便溏;平均體質量和平均進食量日漸下降,有顯著性差異(P<0.05),說明脾胃虛寒模型造模成功;生姜組在第6天給藥后,體質量和進食量逐漸恢復到正常組相當水平(P<0.05),表明生姜溫中散寒作用明顯。2.26各組大鼠血清中6-姜酚、正常組的血藥濃度6-姜酚給藥5min就能在血中檢測到,可維持120min。血藥濃度高,維持的時間長;模型組大鼠血清中6-姜酚的濃度高于正常組。見表2。6-姜烯酚、8-姜酚在正常給藥組血清中沒有檢測到,在模型組中均能檢測到但維持時間短、濃度低。見表3。2.36-姜酚、6-姜烯酚和8-姜酚的組織分布和藥物動力學參數2.3.1組織中6-姜酚的濃度結果表明,6-姜酚在大鼠組織中分布比較廣泛。在正常組和模型組中除了腦組織,其他組織中均可檢測到。6-姜酚的濃度從高到低依次是:胃、小腸、大腸、肝、肺、腎、脾、心,其中在模型組的胃、小腸中的濃度明顯高于正常組。表明6-姜酚的組織中分布對于胃、腸有明顯的趨向。見表4、表5。6-姜烯酚、8-姜酚在正常組大鼠組織中未能檢測到,而在模型組的胃、大腸、小腸、脾中可以檢測到,但除了胃里濃度較高外,腸和脾中濃度均比較低。見表6。2.3.2藥動學參數藥動學參數AUC0-t即血藥濃度-時間曲線下面積,是評價藥物吸收程度的重要指標,由于AUC的大小與藥物吸收后進入體循環(huán)的量成正比,反映了進入體循環(huán)藥物的相對量大小,故不同成分在不同組織中的AUC的數值大小反映了藥物在不同組織中的含量的大小。6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚在大鼠的血清和組織中的藥動學參數如下。數據所示,模型組血清中6-姜酚的AUC0-t大于正常組,不同組織中胃、腸有明顯的吸收,6-姜酚的AUC0-t從大到小依次是:胃、小腸、大腸、肝、肺、腎、脾、心;6-姜烯酚在模型組組織中AUC0-t從大到小是:胃、脾、小腸、大腸;8-姜酚在模型組組織中AUC0-t從大到小是:胃、大腸、小腸、脾。見表7、表8、表9、表10、表11。3討論3.1正常組和見表1生姜的主要有效成分姜酚,是姜及其產品的品質鑒定的依據。本實驗以6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚為對象,用高效液相色譜法對生物樣品中姜酚進行定性定量分析。實驗結果顯示,生姜的3種主要藥效成分在大鼠的胃、腸組織中富集比較多。正常組與脾胃虛寒組比較顯示,6-姜酚在中焦虛寒大鼠的胃有更為明顯的富集,且保留時間更長,上述結果與生姜歸胃經和溫中功效相印證。大腸、小腸同屬消化器官,干姜中3種成分在大腸、小腸中的高濃度,表明生姜歸胃經不僅表現在胃本身有較高的藥物分布濃度,而是表現為消化道都有較高的藥物分布濃度。中醫(yī)認為脾為后天之本,主運化水谷。西醫(yī)認為小腸是重要的消化器官,飲食營養(yǎng)的消化、吸收主要在小腸完成。從功能上看,西醫(yī)小腸與中醫(yī)脾的功能更為接近,故6-姜酚在小腸、大腸的分布實際上與中醫(yī)生姜歸脾經的認識有密切關系。當然,我們在模型動物中也觀察到,6-姜烯酚在脾臟有較高的分布濃度,其實際意義有待于進一步探討。3.2生姜5種有效成分在肺中的分布6-姜酚在肺中有分布,正常組維持時間為20~90min;模型組維持時間為5~120min,但分布濃度明顯低于胃、小腸和大腸。同時6-姜烯酚、8-姜酚在肺中未檢出。從生姜3種有效成分分布上看,在肺中沒